本文關鍵詞：GH-DREB基因轉化小麥及轉基因植株后代的抗旱生理指標鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《西北農(nóng)林科技大學》 2009年

利用RNAi技術進行中國野生葡萄SBP轉錄因子功能研究

侯鴻敏  

【摘要】： 葡萄白粉病(Uncinula necator)是嚴重危害歐洲葡萄的真菌病害之一。本課題組采用mRNA差異顯示和RACE技術(mRNA differential display reverse transcription-PCR, DDRT-PCR)獲得了中國野生葡萄華東葡萄(V. pseudoreticulata)白河-35-1在白粉病病原菌侵染后誘導表達的SBP(SQUAMOSA promoter binding protein, SBP)轉錄因子cDNA。本研究就是通過對中國野生葡萄SBP轉錄因子cDNA序列進行分析,根據(jù)其保守區(qū)、非保守區(qū)設計引物,分別構建以保守區(qū)和非保守區(qū)為目的基因的RNAi植物表達載體,通過花序浸潤法轉化擬南芥,初步了解SBP家族基因的功能。獲得以下主要結果: 1.分別構建了中國野生葡萄SBP轉錄因子cDNA保守區(qū)和非保守區(qū)的RNAi植物表達載體。通過對中國野生葡萄SBP轉錄因子cDNA進行結構分析,預測基因保守和非保守區(qū)域。根據(jù)其保守和非保守區(qū)序列以及pENTRTMTOPO vector要求設計合成兩對特異引物:SBPb-F5’CAC CGC AGG TTT GAC TCC CCT TCA CAT AG 3’, SBPb-R5’AGA GCC ACA CAT ACG CAG ACA GC 3’, SBPf-F5’CAC CGA AAA ATG CAA GCC AAG TAT CAA 3’, SBPf-R5’TCT CAA GAG GAG TTC CAC CAT AG 3’,并進行PCR擴增,將獲得的目的片段定向連接到pENTRTM/D-Topo載體,經(jīng)過PCR檢測和測序分析得到正確入門克隆載體后,分別與目的載體pHellsgate8進行LR反應,利用PCR擴增和XHoI、XBaI單酶切檢測鑒定,獲得SBP轉錄因子保守區(qū)和非保守區(qū)的RNAi植物表達載體pHellsgate8-SBPb和pHellsgate8-SBPf。 2.獲得了具有卡那霉素抗性的轉基因擬南芥植株。通過農(nóng)桿菌介導的花序浸潤法轉化擬南芥,在含卡那霉素40mg/L的MS培養(yǎng)基中對T0代轉化植株的種子進行抗性篩選,獲得了48株pHellsgate8-SBPb轉基因擬南芥和63株pHellsgate8-SBPf轉基因擬南芥。分別提取T1代轉基因擬南芥的DNA,經(jīng)PCR檢測初步證明目的基因已導入擬南芥。 3.中國野生葡萄SBP轉錄因子功能分析。將野生擬南芥和轉基因擬南芥轉入基質中生長兩個月后,對獲得的抗性植株表型進行觀察,在pHellsgate8-SBPb的轉基因植株中發(fā)現(xiàn)一株不抽薹不開花的轉基因突變體植株。與野生型擬南芥相比,其葉色濃綠且葉緣缺刻明顯,營養(yǎng)生長旺盛,而其他抗性植株與野生型擬南芥相比,表現(xiàn)出生長勢較弱,抽薹分枝數(shù)和角果數(shù)都較少。初步證明中國野生葡萄SBP轉錄因子可能與植株抽薹開花有關。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：S663.1
【目錄】：

摘要5-7

ABSTRACT7-11

第一章 文獻綜述11-23

1.1 RNA 干擾技術11-16

1.1.1 RNAi 的發(fā)現(xiàn)11-12

1.1.2 RNA 干擾技術原理12-13

1.1.3 RNAi 作用的特點13-14

1.1.4 RNAi 技術在植物研究中的應用14-16

1.2 植物轉錄因子16-20

1.2.1 轉錄因子的結構17

1.2.2 DNA 結合區(qū)17

1.2.3 轉錄調控區(qū)17-18

1.2.4 與植物抗病反應有關的轉錄因子18-20

1.3 SBP 轉錄因子的研究進展20-22

1.3.1 SBP 轉錄因子的發(fā)現(xiàn)20-21

1.3.2 SBP 家族的功能21-22

1.4 本研究目的意義22-23

第二章 材料和方法23-31

2.1 材料23-24

2.1.1 植物材料23

2.1.2 質粒和菌株23

2.1.3 酶和主要試劑23

2.1.4 主要儀器設備23

2.1.5 常用抗生素貯存液23-24

2.1.6 培養(yǎng)基及緩沖液24

2.2 方法24-31

2.2.1 中國野生葡萄SBP 轉錄因子RNAi 載體的構建24-28

2.2.2 凍融法導入農(nóng)桿菌28-29

2.2.3 轉基因植株的獲得及初步篩選29-30

2.2.4 SBP 轉錄因子功能分析30-31

第三章 結果和分析31-39

3.1 中國野生葡萄SBP 轉錄因子RNAI 載體構建31-37

3.1.1 SBP 轉錄因子cDNA 片段的擴增31

3.1.2 入門克隆載體pENTR~(TM)/D-SBP 的構建及PCR 鑒定31-35

3.1.3 植物干擾表達載體pHellsgate8-SBPb/f 的PCR 和酶切鑒定35

3.1.4 農(nóng)桿菌EHA105 轉化pHellsgate8-SBP 后的PCR 鑒定35-37

3.2 轉基因植株的獲得及初步篩選37

3.2.1 抗卡那霉素(kan)轉基因植株的獲得37

3.2.2 轉基因擬南芥的PCR 檢測37

3.3 SBP 轉錄因子功能分析37-39

第四章 討論39-41

4.1 花序浸潤法轉化擬南芥應注意的問題39

4.2 LR 反應中出現(xiàn)的問題39-40

4.3 關于SBP 轉錄因子功能40-41

第五章 結論41-42

參考文獻42-48

致謝48-49

作者簡介49

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