利用RNAi技術(shù)進(jìn)行中國野生葡萄SBP轉(zhuǎn)錄因子功能研究
本文關(guān)鍵詞：GH-DREB基因轉(zhuǎn)化小麥及轉(zhuǎn)基因植株后代的抗旱生理指標(biāo)鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
《西北農(nóng)林科技大學(xué)》 2009年
利用RNAi技術(shù)進(jìn)行中國野生葡萄SBP轉(zhuǎn)錄因子功能研究
侯鴻敏
【摘要】： 葡萄白粉病(Uncinula necator)是嚴(yán)重危害歐洲葡萄的真菌病害之一。本課題組采用mRNA差異顯示和RACE技術(shù)(mRNA differential display reverse transcription-PCR, DDRT-PCR)獲得了中國野生葡萄華東葡萄(V. pseudoreticulata)白河-35-1在白粉病病原菌侵染后誘導(dǎo)表達(dá)的SBP(SQUAMOSA promoter binding protein, SBP)轉(zhuǎn)錄因子cDNA。本研究就是通過對中國野生葡萄SBP轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列進(jìn)行分析,根據(jù)其保守區(qū)、非保守區(qū)設(shè)計引物,分別構(gòu)建以保守區(qū)和非保守區(qū)為目的基因的RNAi植物表達(dá)載體,通過花序浸潤法轉(zhuǎn)化擬南芥,初步了解SBP家族基因的功能。獲得以下主要結(jié)果: 1.分別構(gòu)建了中國野生葡萄SBP轉(zhuǎn)錄因子cDNA保守區(qū)和非保守區(qū)的RNAi植物表達(dá)載體。通過對中國野生葡萄SBP轉(zhuǎn)錄因子cDNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,預(yù)測基因保守和非保守區(qū)域。根據(jù)其保守和非保守區(qū)序列以及pENTRTMTOPO vector要求設(shè)計合成兩對特異引物:SBPb-F5’CAC CGC AGG TTT GAC TCC CCT TCA CAT AG 3’, SBPb-R5’AGA GCC ACA CAT ACG CAG ACA GC 3’, SBPf-F5’CAC CGA AAA ATG CAA GCC AAG TAT CAA 3’, SBPf-R5’TCT CAA GAG GAG TTC CAC CAT AG 3’,并進(jìn)行PCR擴增,將獲得的目的片段定向連接到pENTRTM/D-Topo載體,經(jīng)過PCR檢測和測序分析得到正確入門克隆載體后,分別與目的載體pHellsgate8進(jìn)行LR反應(yīng),利用PCR擴增和XHoI、XBaI單酶切檢測鑒定,獲得SBP轉(zhuǎn)錄因子保守區(qū)和非保守區(qū)的RNAi植物表達(dá)載體pHellsgate8-SBPb和pHellsgate8-SBPf。 2.獲得了具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸潤法轉(zhuǎn)化擬南芥,在含卡那霉素40mg/L的MS培養(yǎng)基中對T0代轉(zhuǎn)化植株的種子進(jìn)行抗性篩選,獲得了48株pHellsgate8-SBPb轉(zhuǎn)基因擬南芥和63株pHellsgate8-SBPf轉(zhuǎn)基因擬南芥。分別提取T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥的DNA,經(jīng)PCR檢測初步證明目的基因已導(dǎo)入擬南芥。 3.中國野生葡萄SBP轉(zhuǎn)錄因子功能分析。將野生擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥轉(zhuǎn)入基質(zhì)中生長兩個月后,對獲得的抗性植株表型進(jìn)行觀察,在pHellsgate8-SBPb的轉(zhuǎn)基因植株中發(fā)現(xiàn)一株不抽薹不開花的轉(zhuǎn)基因突變體植株。與野生型擬南芥相比,其葉色濃綠且葉緣缺刻明顯,營養(yǎng)生長旺盛,而其他抗性植株與野生型擬南芥相比,表現(xiàn)出生長勢較弱,抽薹分枝數(shù)和角果數(shù)都較少。初步證明中國野生葡萄SBP轉(zhuǎn)錄因子可能與植株抽薹開花有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：S663.1
【目錄】：
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3 馬冬芹;油葵PEPC基因保守序列的克隆及RNAi載體的構(gòu)建[D];河北科技大學(xué);2011年
4 劉霞;腺病毒載體介導(dǎo)的RNAi抑制肺間質(zhì)纖維化大鼠TGF-β1基因表達(dá)的研究[D];鄭州大學(xué);2010年
5 趙留芳;RNAi介導(dǎo)survivin抑制鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤的實驗研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年
6 張國峰;慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi抑制牛整聯(lián)蛋白亞基αv基因表達(dá)的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年
7 馬玥;靶向hTERT的肝特異性RNAi載體的構(gòu)建與鑒定[D];鄭州大學(xué);2010年
8 王旭;利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)沉默細(xì)胞中MKK6的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2010年
9 李開東;利用雙T-DNA載體系統(tǒng)和RNAi培育抗水稻條紋病毒轉(zhuǎn)基因水稻[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年
10 唐巧玲;陸地棉纖維發(fā)育相關(guān)基因GhBOTERO和GhCOBRA的克隆及功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2005年
本文關(guān)鍵詞：GH-DREB基因轉(zhuǎn)化小麥及轉(zhuǎn)基因植株后代的抗旱生理指標(biāo)鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
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