本文關鍵詞： 斯氏副柔線蟲 轉錄組 蛋白質組 分泌基因/蛋白 iELISA　出處：《內蒙古農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：斯氏副柔線蟲是一種寄生于反芻動物真胃的吸血性線蟲,駱駝是其最適宜宿主。大量感染斯氏副柔線蟲后,可導致駱駝拉稀、貧血甚至死亡,嚴重危害駱駝健康。在國內外,有關斯氏副柔線蟲的基礎理論研究,生前診斷和免疫防治研究均未見報道。本研究對駱駝斯氏副柔線蟲蟲卵、第三期幼蟲、雌蟲和雄蟲分別進行轉錄組和蛋白質組學研究,并利用熒光定量PCR方法驗證轉錄組分析結果,同時整合分析兩組學數(shù)據(jù),揭示不同發(fā)育階段斯氏副柔線蟲生物學特征,以探明不同發(fā)育階段蟲體在mRNA和蛋白水平上的差異,發(fā)掘免疫相關分泌性基因和蛋白,最終篩選了3個斯氏副柔線蟲特有分泌基因進行重組表達和免疫原性鑒定;并利用重組抗原建立了斯氏副柔線蟲病iELISA診斷方法,為該病的免疫防治研究奠定了基礎。主要研究結果如下:1.通過對斯氏副柔線蟲蟲卵、第三期幼蟲、雌蟲和雄蟲的轉綠組測序,共獲得超過10GB的有效數(shù)據(jù)量,拼接組裝、優(yōu)化處理數(shù)據(jù)后得到54102個Unigenes,其中33816個Unigenes為差異表達基因,32006個Unigenes具有功能注釋�；驎r序表達中描繪出4個階段蟲體的表達模式特征,蟲卵階段主要富集在蛋白質合成功能上;第三期幼蟲階段中幼蟲發(fā)育和自身免疫保護等功能基因表達明顯;雄蟲主要富集在精子形成和能量代謝等功能;而雌蟲主要富集在參與受精和激活精子進入等功能。qPCR檢測了 12個各階段高富集基因,結果有11個基因的表達趨勢與轉錄組測序結果一致。比較轉錄組學研究中,對成對比較的差異表達基因進行統(tǒng)計,G0功能分類和KEGG代謝通路分析,推斷出蟲卵與第三期幼蟲、第三期幼蟲與成蟲(coFemale/Male)、雌蟲與雄蟲的轉錄模式改變特征。預測了 1975個候選斯氏副柔線蟲免疫相關分泌性基因,鑒定出多種重要的功能性分泌抗原基因。2.通過對斯氏副柔線蟲第三期幼蟲、雌蟲和雄蟲的蛋白質組學研究,共鑒定到2072個蛋白質,其中有2009(97.0%)個蛋白具有功能注釋。對成蟲和第三期幼蟲、雌蟲和雄蟲比較的差異蛋白進行分析,結果表明成蟲和幼蟲的差異蛋白顯著富集在幼蟲發(fā)育、生長正調控和成蟲壽命調控等功能分類中;主要參與核糖體,氧化磷酸化和丙酮酸鹽代謝等通路。雌蟲和雄蟲的差異蛋白顯著富集在生殖相關的功能分類中;主要參與細胞骨架調節(jié)、PPAR信號通路和血管平滑肌收縮等通路。篩選出197個分泌性蛋白,并對其表達情況進行了分析。3.對兩組學數(shù)據(jù)中的差異基因/蛋白進行數(shù)量、表達量和功能分類比較關聯(lián)分析,結果發(fā)現(xiàn)差異基因和差異蛋白的數(shù)量、表達量、功能分類和代謝通路調控在兩組學水平上有較高的一致性。4.結合兩組學預測的分泌性基因/蛋白數(shù)據(jù),篩選出9個重要的分泌性基因作為斯氏副柔線蟲免疫相關抗原的候選基因進行了克隆測序分析,并成功構建了BL21(pETSTPK)、BL21(pETCPI)和 BL21(pETCPR)三個重組表達系統(tǒng)。WB 檢測發(fā)現(xiàn)重組蛋白rSTPK、rCPI和rCPR能夠與感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清中的抗體發(fā)生特異性結合反應,具有較高的特異性和較好的免疫原性。5.以重組蛋白rSTPK、rCPI和rCPR作為抗原,成功建立了斯氏副柔線蟲重組抗原rSTPK、rCPI和rCPR的iELISA診斷方法。利用建立的三個重組抗原iELISA診斷方法對81份已知陽性血清和9份已知陰性血清進行檢測,發(fā)現(xiàn)三個重組抗原的特異性均為100%;重組抗原rSTPK、rCPI和rCPR的敏感性分別為97.5%、98.8%和96.3%,且均具有良好的重復性。通過對140份田間駱駝血清進行iELISA檢測,發(fā)現(xiàn)建立的三個重組抗原iELISA檢測方法在陽性檢出率上無顯著差異(P0.05),均可用于斯氏副柔線蟲病的血清學診斷。
[Abstract]:In this study , we have studied the biological characteristics of P.S . parasequinata . The results of this study are as follows : 1 . It has been used to study the biological characteristics of the four stages of the disease . The results of this study are as follows : 1 . The research results are as follows : 1 . The study of the basic theory of the parasequindes , the third stage larvae , the female and the male . The results of this study are as follows : 1 . The study shows that the expression patterns of the four stages are different from those of the third stage larvae , the third stage larvae and the adult worms . The recombinant protein rSTPK , rCPI and rCPR were cloned and sequenced . The results showed that the recombinant protein rSTPK , rCPI and rCPR could be used as antigen to detect the specific binding of recombinant antigen rSTPK , rCPI and rCPR .

【學位授予單位】：內蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

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本文編號：1527215