本文關(guān)鍵詞： 斯氏副柔線蟲 轉(zhuǎn)錄組 蛋白質(zhì)組 分泌基因/蛋白 iELISA　出處：《內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：斯氏副柔線蟲是一種寄生于反芻動物真胃的吸血性線蟲,駱駝是其最適宜宿主。大量感染斯氏副柔線蟲后,可導(dǎo)致駱駝拉稀、貧血甚至死亡,嚴(yán)重危害駱駝健康。在國內(nèi)外,有關(guān)斯氏副柔線蟲的基礎(chǔ)理論研究,生前診斷和免疫防治研究均未見報道。本研究對駱駝斯氏副柔線蟲蟲卵、第三期幼蟲、雌蟲和雄蟲分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究,并利用熒光定量PCR方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果,同時整合分析兩組學(xué)數(shù)據(jù),揭示不同發(fā)育階段斯氏副柔線蟲生物學(xué)特征,以探明不同發(fā)育階段蟲體在mRNA和蛋白水平上的差異,發(fā)掘免疫相關(guān)分泌性基因和蛋白,最終篩選了3個斯氏副柔線蟲特有分泌基因進(jìn)行重組表達(dá)和免疫原性鑒定;并利用重組抗原建立了斯氏副柔線蟲病iELISA診斷方法,為該病的免疫防治研究奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.通過對斯氏副柔線蟲蟲卵、第三期幼蟲、雌蟲和雄蟲的轉(zhuǎn)綠組測序,共獲得超過10GB的有效數(shù)據(jù)量,拼接組裝、優(yōu)化處理數(shù)據(jù)后得到54102個Unigenes,其中33816個Unigenes為差異表達(dá)基因,32006個Unigenes具有功能注釋�；驎r序表達(dá)中描繪出4個階段蟲體的表達(dá)模式特征,蟲卵階段主要富集在蛋白質(zhì)合成功能上;第三期幼蟲階段中幼蟲發(fā)育和自身免疫保護(hù)等功能基因表達(dá)明顯;雄蟲主要富集在精子形成和能量代謝等功能;而雌蟲主要富集在參與受精和激活精子進(jìn)入等功能。qPCR檢測了 12個各階段高富集基因,結(jié)果有11個基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中,對成對比較的差異表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì),G0功能分類和KEGG代謝通路分析,推斷出蟲卵與第三期幼蟲、第三期幼蟲與成蟲(coFemale/Male)、雌蟲與雄蟲的轉(zhuǎn)錄模式改變特征。預(yù)測了 1975個候選斯氏副柔線蟲免疫相關(guān)分泌性基因,鑒定出多種重要的功能性分泌抗原基因。2.通過對斯氏副柔線蟲第三期幼蟲、雌蟲和雄蟲的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,共鑒定到2072個蛋白質(zhì),其中有2009(97.0%)個蛋白具有功能注釋。對成蟲和第三期幼蟲、雌蟲和雄蟲比較的差異蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果表明成蟲和幼蟲的差異蛋白顯著富集在幼蟲發(fā)育、生長正調(diào)控和成蟲壽命調(diào)控等功能分類中;主要參與核糖體,氧化磷酸化和丙酮酸鹽代謝等通路。雌蟲和雄蟲的差異蛋白顯著富集在生殖相關(guān)的功能分類中;主要參與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、PPAR信號通路和血管平滑肌收縮等通路。篩選出197個分泌性蛋白,并對其表達(dá)情況進(jìn)行了分析。3.對兩組學(xué)數(shù)據(jù)中的差異基因/蛋白進(jìn)行數(shù)量、表達(dá)量和功能分類比較關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異基因和差異蛋白的數(shù)量、表達(dá)量、功能分類和代謝通路調(diào)控在兩組學(xué)水平上有較高的一致性。4.結(jié)合兩組學(xué)預(yù)測的分泌性基因/蛋白數(shù)據(jù),篩選出9個重要的分泌性基因作為斯氏副柔線蟲免疫相關(guān)抗原的候選基因進(jìn)行了克隆測序分析,并成功構(gòu)建了BL21(pETSTPK)、BL21(pETCPI)和 BL21(pETCPR)三個重組表達(dá)系統(tǒng)。WB 檢測發(fā)現(xiàn)重組蛋白rSTPK、rCPI和rCPR能夠與感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清中的抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),具有較高的特異性和較好的免疫原性。5.以重組蛋白rSTPK、rCPI和rCPR作為抗原,成功建立了斯氏副柔線蟲重組抗原rSTPK、rCPI和rCPR的iELISA診斷方法。利用建立的三個重組抗原iELISA診斷方法對81份已知陽性血清和9份已知陰性血清進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)三個重組抗原的特異性均為100%;重組抗原rSTPK、rCPI和rCPR的敏感性分別為97.5%、98.8%和96.3%,且均具有良好的重復(fù)性。通過對140份田間駱駝血清進(jìn)行iELISA檢測,發(fā)現(xiàn)建立的三個重組抗原iELISA檢測方法在陽性檢出率上無顯著差異(P0.05),均可用于斯氏副柔線蟲病的血清學(xué)診斷。
[Abstract]:In this study , we have studied the biological characteristics of P.S . parasequinata . The results of this study are as follows : 1 . It has been used to study the biological characteristics of the four stages of the disease . The results of this study are as follows : 1 . The research results are as follows : 1 . The study of the basic theory of the parasequindes , the third stage larvae , the female and the male . The results of this study are as follows : 1 . The study shows that the expression patterns of the four stages are different from those of the third stage larvae , the third stage larvae and the adult worms . The recombinant protein rSTPK , rCPI and rCPR were cloned and sequenced . The results showed that the recombinant protein rSTPK , rCPI and rCPR could be used as antigen to detect the specific binding of recombinant antigen rSTPK , rCPI and rCPR .

【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

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本文編號：1527215