本文關(guān)鍵詞： 同源重組 凋亡素 腺病毒 人結(jié)腸癌細(xì)胞　出處：《中國老年學(xué)雜志》2017年18期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶凋亡素VP3基因的重組腺病毒并觀察其在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的表達(dá)。方法擴(kuò)增目的基因VP3 cDNA,與EcoRⅤ酶切線性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭質(zhì)粒連接構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-VP3-hrGFP,PmeⅠ酶切線性化pShuttleVP3-hrGFP并轉(zhuǎn)化含pAdeasy-1的超感受態(tài)BJ5183大腸桿菌,細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd-VP3-hrGFP,并經(jīng)PCR、EcoRⅤ、PacⅠ酶切電泳及測序鑒定,線性化的重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞進(jìn)行重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增,CsCI密度梯度離心法行病毒濃縮和純化并將其感染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),觀察其感染效率及VP3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建鑒定成功,PCR反應(yīng)擴(kuò)增出402 bp的片段;pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)測序證實(shí)VP3-hrGFP編碼區(qū)成功克隆入腺病毒p Ad中,且其序列與Gen Bank中VP3 CDNA序列完全一致。成功包裝出攜帶VP3基因的重組腺病毒,滴度為1.738×10~(12)opu/ml,重組腺病毒可在SW480細(xì)胞內(nèi)得到有效表達(dá)。結(jié)論用細(xì)菌內(nèi)同源重組法可快速、高效地制備攜帶凋亡素VP3基因的重組腺病毒,并可在人結(jié)腸癌細(xì)胞中高效表達(dá)。
[Abstract]:Objective to construct a recombinant adenovirus carrying apoptin VP3 gene and observe its expression in human colon cancer SW480 cells by homologous recombination in bacteria. Methods the target gene VP3 cDNA was amplified and ligated with pShuttle-IRES-hrGFP shuttle plasmid digested by EcoR 鈪，

本文編號：1525051