本文關(guān)鍵詞： 顱內(nèi)動脈瘤 易感基因 ARHGEF17 全基因組測序 全基因組外顯子測序　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景顱內(nèi)動脈瘤(intracranial aneurysm,IA)破裂后病死率大約40%。國內(nèi)有關(guān)顱內(nèi)未破裂動脈瘤流行病學(xué)的研究,發(fā)現(xiàn)我國動脈瘤患病率約為7%,高于歐美其他國家的患病率。其病因迄今尚未十分清楚,目前多認(rèn)為IA是一種在先天遺傳因素和多種后天環(huán)境因素共同作用下發(fā)生的復(fù)雜性疾病。目的通過本課題研究,探尋出顱內(nèi)動脈瘤人群的易感基因及其變異特點(diǎn)。在IA的遺傳學(xué)研究方面提供更準(zhǔn)確和全面的基因組信息,在臨床方面為IA的診斷和篩選提供分子標(biāo)記物,為IA的防治提供新的靶點(diǎn),為提高IA診斷和治療水平奠定基礎(chǔ)。內(nèi)容(1)確定研究對象并收集樣本,同時利用全基因組測序技術(shù)進(jìn)行測序。在本單位和合作單位中,通過臨床先證者尋找到10個FIA家系,收集家系患者的外周血液樣本;臨床收集散發(fā)顱內(nèi)動脈瘤患者290例外周血液樣本和257例健康對照組的外周血液樣本,提取DNA。我們將對收集到的10例FIA血液樣本DNA進(jìn)行全基因組測序(WGS)測序工作;對收集到的10例FIA血液樣本DNA進(jìn)行全基因組外顯子測序(WES)測序工作。(2)依據(jù)全基因組測序結(jié)果,通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)可疑易感基因。本課題將通過對家族性顱內(nèi)動脈瘤進(jìn)行全基因組測序和全基因組外顯子測序及序列比對,找到單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP),結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)(SV,Structure Variation)、插入缺失位點(diǎn)(In Del,Insertion/Deletion)、拷貝數(shù)變異(CNV,Copy number variations)等變異信息。通過生物信息學(xué)注釋和分析,從中初步篩選出與IA相關(guān)的易感基因。(3)借助分子生物學(xué)技術(shù)、Sanger測序技術(shù)等驗(yàn)證相關(guān)遺傳變異、檢測易感基因在散發(fā)動脈瘤中的表達(dá)。針對通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)的SNP、SV、CNV、In Del等多種遺傳變異,在散發(fā)顱內(nèi)動脈瘤患者290例外周血液樣本和257例健康對照組的外周血液樣本DNA中,采用不同方法對不同的變異類型進(jìn)行驗(yàn)證。(4)借助體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IA相關(guān)遺傳變異在血管形成中的作用。體外實(shí)驗(yàn)利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系,該細(xì)胞系具有干細(xì)胞的潛能,體外在內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的作用下可以迅速增殖傳代,我們通過基因敲除技術(shù)敲除IA相關(guān)變異位點(diǎn),探討在血管形成和細(xì)胞遷移方面易感基因的功能。方法(1)獲得FIA患者DNA樣本、散發(fā)患者DNA樣本以及對照組樣本。通過調(diào)查問卷發(fā)現(xiàn)FIA家系,簽訂知情同意書,采集FIA患者以及家系成員血液樣本,提取DNA。在臨床散發(fā)患者知情同意后,留取患者血液樣本,提取DNA;對照組DNA取自健康志愿者。所有樣本獲取以后迅速放置于-80℃冰箱中儲存。(2)對FIA患者進(jìn)行WGS測序和數(shù)據(jù)分析。20例FIA樣本行WGS和WES測序。所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,同時與千人基因組數(shù)據(jù)庫以及外顯子組集合聯(lián)合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,在歐洲和日本人群進(jìn)一步驗(yàn)證。(3)對WGS測序所得結(jié)果在散發(fā)動脈瘤患者上進(jìn)行驗(yàn)證。首先對WGS和WES所得結(jié)果進(jìn)行直接驗(yàn)證。(1)SNPs可采用SNP分型檢測的方法驗(yàn)證。(2)CNVs可通過Real-time PCR對存在拷貝數(shù)變異的片段進(jìn)行擴(kuò)增,并根據(jù)CT值估算不同個體的拷貝數(shù)變化倍數(shù)。(3)通過PCR擴(kuò)增和測序辨別小的SVs,通過亞顯微方法發(fā)現(xiàn)大的SVs。(4)通過PCR擴(kuò)增,利用Sanger法測序?qū)π∑蔚腎n Del進(jìn)行驗(yàn)證。(4)基因干涉體外細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。利用基因沉默技術(shù),降低篩選出的IA相關(guān)易感基因在血管內(nèi)皮的表達(dá),通過體外細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn),在細(xì)胞水平觀察血管生成的過程,從而觀察IA易感基因在人血管形成機(jī)制中的作用,如內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、形成毛細(xì)血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的情況等。結(jié)果(1)本課題最后總共納入10個家族性顱內(nèi)動脈瘤家系中的20名FIA患者進(jìn)行WGS和WES測序,發(fā)現(xiàn)IA相關(guān)新易感基因ARHGEF17。(2)在散發(fā)顱內(nèi)動脈瘤患者290例外周血液樣本和257例健康對照組的外周血液樣本DNA中驗(yàn)證新易感基因ARHGEF17的5個變異位點(diǎn)存在差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(3)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明易感基因ARHGEF17可以促進(jìn)血管形成和內(nèi)皮細(xì)胞增殖。結(jié)論基因ARHGEF17在顱內(nèi)動脈瘤形成中具有重要作用,是顱內(nèi)動脈瘤新易感基因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3

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本文編號：1509456