發(fā)布時(shí)間：2018-02-13 03:19

  本文關(guān)鍵詞： miR-106a 膠質(zhì)細(xì)胞瘤 WNT信號(hào) APC 侵襲　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞瘤是腦科最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤,它是人類最致命的腫瘤之一,盡管在過(guò)去幾十年的治療中不斷取得一些進(jìn)展,但仍以腦外科治療為主,愈后效率很差,在歐美地區(qū)5年生存率平均小于3%。探索新的治療一直是科研工作者的追求。近年來(lái),科學(xué)家發(fā)現(xiàn)非編碼mi RNA在生命的調(diào)節(jié)過(guò)程中起到重要的作用,本課題就是從這方面出發(fā),尋找在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)差異的mi RNA,通過(guò)過(guò)表達(dá)及干擾所研究的mi RNA,確定其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞相關(guān)功能的影響,并找出其可能的信號(hào)通路及調(diào)控的靶基因,這些是本課題研究的目的所在。方法:收集膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本8例(腦膠質(zhì)瘤外科手術(shù)獲得),正常腦組織3例(腦外傷后需手術(shù)清除的腦挫裂傷組織)。正常神經(jīng)細(xì)胞NHA以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG、U118MG。提取RNA后檢測(cè)其純度和濃度,運(yùn)用QPCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)mi R-106a的相對(duì)表達(dá)量。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)mi R-106a的細(xì)胞株,從DNA模板中擴(kuò)增包含mi R-106a前體的上下游多延長(zhǎng)200bp的片段,構(gòu)建慢病毒載體,包裝成慢病毒,然后感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)mi R-106a和mi R-106a-sh RNA的細(xì)胞株,用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn):1)MTT實(shí)驗(yàn),接種細(xì)胞到96孔板中,分別培養(yǎng)1-4天,每孔中加入MTT溶液呈色,選擇490nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色,記錄結(jié)果并繪制生長(zhǎng)曲線;2)細(xì)胞周期檢測(cè),用PI染細(xì)胞核,用一定激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)產(chǎn)生熒光,熒光的強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)DNA的含量成正比,激發(fā)的熒光基團(tuán)強(qiáng)弱被機(jī)器識(shí)別后,可以讀出細(xì)胞各個(gè)發(fā)育時(shí)期的變化水平;3)侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè),37℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)12h、24h、36h后,取出transwell小室,每組重復(fù)3個(gè)樣本。其中1個(gè)小室棄去培養(yǎng)基,用無(wú)鈣的PBS洗3遍,4%多聚甲醛固定10min,棉簽擦掉上層未遷移的細(xì)胞,PBS洗3遍,結(jié)晶紫染色染色,在顯微鏡下觀察。剩余3個(gè)小室將其下層遷移細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化,計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù),或直接取幾個(gè)視野計(jì)數(shù)取平均值;4)檢測(cè)細(xì)胞中Sanil、RUNX2、CD44、SOX9、OCT4、ALP基因的表達(dá)相對(duì)水平,提取各組細(xì)胞中的RNA,逆轉(zhuǎn)錄后上機(jī)進(jìn)行PCR反應(yīng);5)提取各組細(xì)胞中的蛋白,進(jìn)行蛋白濃度及純度檢測(cè),并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,用WB法檢測(cè)Cyclin D1、p-p Rb、p Rb、MMP2蛋白含量;6)染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè),提取核DNA并用超聲波處理,進(jìn)行MMP2、Nanog、C-myc抗體孵育,解離收集DNA并運(yùn)用QPCR法進(jìn)行DNA含量檢測(cè);7)運(yùn)用試劑盒檢測(cè)TOP/FOP的相對(duì)比值,用以檢測(cè)β-catenin入核水平;8)熒光素酶檢測(cè)mi R-106a與APC相互調(diào)控關(guān)系,同時(shí)檢測(cè)APC-3’端突變體。結(jié)果:QPCR檢測(cè)3例正常腦組織與8例膠質(zhì)瘤組織數(shù)據(jù)所示,8例表達(dá)都高于正常組織,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG、U118MG相對(duì)正常腦細(xì)胞NHA都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.233,P0.01)。MTT結(jié)果提示轉(zhuǎn)了抑制mi R-106a的細(xì)胞比對(duì)照和過(guò)表達(dá)mi R-106a的細(xì)胞的生長(zhǎng)速度慢,而過(guò)表達(dá)mi R-106a的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖快,從到達(dá)第4天時(shí)增殖的細(xì)胞數(shù)看,轉(zhuǎn)染了抑制mi R-106a的達(dá)到了2.8的基數(shù),而對(duì)照和過(guò)表達(dá)mi R-106a的基數(shù)分別為4.0和6.0。對(duì)細(xì)胞周期檢測(cè)后結(jié)果顯示,對(duì)照組G1/G0=60.46%,S=32.85%,G2/M=6.69%。過(guò)表達(dá)組G1/G0=32.29%,S=57.63%,G2/M=6.08%。抑制組G1/G0=73.71%,S=19.04%,G2/M=7.25%,過(guò)表達(dá)組細(xì)胞S期顯著比對(duì)照組高,過(guò)表達(dá)mi R-106a后細(xì)胞增殖加快。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,在3個(gè)不同的視野計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性細(xì)胞,過(guò)表達(dá)mi R-106a組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為3.53±0.13,明顯比對(duì)照組高,統(tǒng)計(jì)(T=-33.71,P0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而抑制mi R-106a組細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)為0.21±0.05,較對(duì)照組少,統(tǒng)計(jì)(T=27.37,P0.01),有統(tǒng)計(jì)意義。TOP/FOP結(jié)果顯示,相對(duì)于對(duì)照組,過(guò)表達(dá)mi R-106a組其活性值為3.5±0.056,統(tǒng)計(jì)檢測(cè)T=-74.66,P0.01。而抑制mi R-106a組其活性值為0.23±0.019,統(tǒng)計(jì)檢測(cè)T=78.45,P0.01。CHIP結(jié)果顯示基因MMP2、Nanog、c-My C的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組,過(guò)表達(dá)和抑制mi R-106a組都有意義P0.01。熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示,相對(duì)于對(duì)照組,過(guò)表達(dá)mi R-106a相對(duì)熒光質(zhì)為0.279±0.021(T=59.467,P0.01),而抑制組為1.832±0.076(T=-18.961,P0.01),而突變組相對(duì)對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。結(jié)論:我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)mi R-106a通過(guò)靶向調(diào)控APC基因,并通過(guò)WNT信號(hào)通路對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響,這為mi R-106a在針對(duì)人腦膠質(zhì)瘤的治療方式上提供了新的思路。所有的統(tǒng)計(jì)采用的統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((χ|-)±s)來(lái)表示。兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用T檢驗(yàn),P0.05認(rèn)為差異有顯著意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 郝建偉;浦佩玉;張春智;;膠質(zhì)瘤中微RNA研究進(jìn)展[J];國(guó)際腫瘤學(xué)雜志;2010年03期

2 王黎;張勇;李曉宇;劉磊;;脂肪基質(zhì)細(xì)胞脂向分化過(guò)程中MicroRNA-134的表達(dá)變化[J];廣東醫(yī)學(xué);2009年04期

3 王偉民;;重視神經(jīng)膠質(zhì)瘤手術(shù)治療的方法研究[J];中華神經(jīng)外科雜志;2008年04期

，

本文編號(hào)：1507207