本文關鍵詞： miR-106a 膠質細胞瘤 WNT信號 APC 侵襲　出處：《新疆醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:惡性膠質瘤細胞瘤是腦科最常見的原發(fā)性腫瘤,它是人類最致命的腫瘤之一,盡管在過去幾十年的治療中不斷取得一些進展,但仍以腦外科治療為主,愈后效率很差,在歐美地區(qū)5年生存率平均小于3%。探索新的治療一直是科研工作者的追求。近年來,科學家發(fā)現(xiàn)非編碼mi RNA在生命的調(diào)節(jié)過程中起到重要的作用,本課題就是從這方面出發(fā),尋找在膠質瘤細胞和正常神經(jīng)細胞中表達差異的mi RNA,通過過表達及干擾所研究的mi RNA,確定其對膠質瘤細胞相關功能的影響,并找出其可能的信號通路及調(diào)控的靶基因,這些是本課題研究的目的所在。方法:收集膠質母細胞瘤組織標本8例(腦膠質瘤外科手術獲得),正常腦組織3例(腦外傷后需手術清除的腦挫裂傷組織)。正常神經(jīng)細胞NHA以及膠質瘤細胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG、U118MG。提取RNA后檢測其純度和濃度,運用QPCR技術進行檢測mi R-106a的相對表達量。構建穩(wěn)定表達mi R-106a的細胞株,從DNA模板中擴增包含mi R-106a前體的上下游多延長200bp的片段,構建慢病毒載體,包裝成慢病毒,然后感染膠質瘤細胞,構建穩(wěn)定表達mi R-106a和mi R-106a-sh RNA的細胞株,用于進行實驗:1)MTT實驗,接種細胞到96孔板中,分別培養(yǎng)1-4天,每孔中加入MTT溶液呈色,選擇490nm波長進行比色,記錄結果并繪制生長曲線;2)細胞周期檢測,用PI染細胞核,用一定激發(fā)波長激發(fā)產(chǎn)生熒光,熒光的強度與細胞內(nèi)DNA的含量成正比,激發(fā)的熒光基團強弱被機器識別后,可以讀出細胞各個發(fā)育時期的變化水平;3)侵襲實驗檢測,37℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)12h、24h、36h后,取出transwell小室,每組重復3個樣本。其中1個小室棄去培養(yǎng)基,用無鈣的PBS洗3遍,4%多聚甲醛固定10min,棉簽擦掉上層未遷移的細胞,PBS洗3遍,結晶紫染色染色,在顯微鏡下觀察。剩余3個小室將其下層遷移細胞用0.25%胰蛋白酶消化,計算遷移細胞數(shù),或直接取幾個視野計數(shù)取平均值;4)檢測細胞中Sanil、RUNX2、CD44、SOX9、OCT4、ALP基因的表達相對水平,提取各組細胞中的RNA,逆轉錄后上機進行PCR反應;5)提取各組細胞中的蛋白,進行蛋白濃度及純度檢測,并繪制標準曲線,用WB法檢測Cyclin D1、p-p Rb、p Rb、MMP2蛋白含量;6)染色質免疫共沉淀檢測,提取核DNA并用超聲波處理,進行MMP2、Nanog、C-myc抗體孵育,解離收集DNA并運用QPCR法進行DNA含量檢測;7)運用試劑盒檢測TOP/FOP的相對比值,用以檢測β-catenin入核水平;8)熒光素酶檢測mi R-106a與APC相互調(diào)控關系,同時檢測APC-3’端突變體。結果:QPCR檢測3例正常腦組織與8例膠質瘤組織數(shù)據(jù)所示,8例表達都高于正常組織,比較有統(tǒng)計學意義(P0.01)。膠質瘤細胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG、U118MG相對正常腦細胞NHA都有統(tǒng)計學意義(F=0.233,P0.01)。MTT結果提示轉了抑制mi R-106a的細胞比對照和過表達mi R-106a的細胞的生長速度慢,而過表達mi R-106a的細胞生長增殖快,從到達第4天時增殖的細胞數(shù)看,轉染了抑制mi R-106a的達到了2.8的基數(shù),而對照和過表達mi R-106a的基數(shù)分別為4.0和6.0。對細胞周期檢測后結果顯示,對照組G1/G0=60.46%,S=32.85%,G2/M=6.69%。過表達組G1/G0=32.29%,S=57.63%,G2/M=6.08%。抑制組G1/G0=73.71%,S=19.04%,G2/M=7.25%,過表達組細胞S期顯著比對照組高,過表達mi R-106a后細胞增殖加快。侵襲實驗顯示,在3個不同的視野計數(shù)染色陽性細胞,過表達mi R-106a組陽性細胞數(shù)為3.53±0.13,明顯比對照組高,統(tǒng)計(T=-33.71,P0.01),有統(tǒng)計學意義。而抑制mi R-106a組細胞陽性數(shù)為0.21±0.05,較對照組少,統(tǒng)計(T=27.37,P0.01),有統(tǒng)計意義。TOP/FOP結果顯示,相對于對照組,過表達mi R-106a組其活性值為3.5±0.056,統(tǒng)計檢測T=-74.66,P0.01。而抑制mi R-106a組其活性值為0.23±0.019,統(tǒng)計檢測T=78.45,P0.01。CHIP結果顯示基因MMP2、Nanog、c-My C的表達相對于對照組,過表達和抑制mi R-106a組都有意義P0.01。熒光素酶檢測結果顯示,相對于對照組,過表達mi R-106a相對熒光質為0.279±0.021(T=59.467,P0.01),而抑制組為1.832±0.076(T=-18.961,P0.01),而突變組相對對照組無統(tǒng)計意義。結論:我們的實驗證實mi R-106a通過靶向調(diào)控APC基因,并通過WNT信號通路對人腦膠質瘤細胞的增殖產(chǎn)生影響,這為mi R-106a在針對人腦膠質瘤的治療方式上提供了新的思路。所有的統(tǒng)計采用的統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析。結果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((χ|-)±s)來表示。兩個樣本均數(shù)比較采用T檢驗,P0.05認為差異有顯著意義。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 郝建偉;浦佩玉;張春智;;膠質瘤中微RNA研究進展[J];國際腫瘤學雜志;2010年03期

2 王黎;張勇;李曉宇;劉磊;;脂肪基質細胞脂向分化過程中MicroRNA-134的表達變化[J];廣東醫(yī)學;2009年04期

3 王偉民;;重視神經(jīng)膠質瘤手術治療的方法研究[J];中華神經(jīng)外科雜志;2008年04期

，

本文編號：1507207