本文關(guān)鍵詞： 苦蕎 金屬硫蛋白 啟動(dòng)子 重金屬 原核表達(dá) 蛋白純化　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：金屬硫蛋白(metallothioneins,MTs)是一類富含半胱氨酸的低分子量蛋白,在植物重金屬耐受性中發(fā)揮重要的作用。苦蕎(Fagopyrum tataricum)含有豐富的黃酮類物質(zhì),是重要的藥食兩用作物,其具有耐瘠薄、抗重金屬等良好的抗逆性。但目前為止,尚未見有關(guān)于苦蕎重金屬抗逆機(jī)理和苦蕎金屬硫蛋白表達(dá)調(diào)控以及功能的相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過克隆苦蕎Ⅱ型金屬硫蛋白基因序列(FtMT2),構(gòu)建FtMT2過表達(dá)的大腸桿菌、酵母及擬南芥,并測(cè)定重組蛋白的羥自由基去除能力,以期揭示FtMT2在苦蕎重金屬耐受中的功能;通過FtMT2啟動(dòng)子序列的克隆,預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件,構(gòu)建不同截短啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告載體,采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化苦蕎葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體研究FtMT2啟動(dòng)子對(duì)Cu2+的響應(yīng),以期揭示FtMT2基因啟動(dòng)子活性的響應(yīng)模式。FtMT2的克隆及其啟動(dòng)子的功能分析對(duì)于建立Cu2+污染的檢測(cè)技術(shù)具有參考價(jià)值,同時(shí)為解析苦蕎重金屬抗性的內(nèi)在機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究得到的主要結(jié)果和結(jié)論有:(1)FtMT2基因含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子分隔,內(nèi)含子邊界符合“5′-GT”和“AG-3′”規(guī)則。FtMT2編碼區(qū)為237 bp,編碼78個(gè)氨基酸;預(yù)測(cè)的編碼蛋白的分子質(zhì)量為7.885 kD,等電點(diǎn)4.55,蛋白序列中含有14個(gè)Cys,在N-端含有“C-C,C-X-C,C-X-X-C”模體以及高度保守的“MSCCGGNCGCGS”序列,C-端含有3個(gè)“C-X-C”模體。N-端和C-端的結(jié)構(gòu)被42個(gè)氨基酸的連接區(qū)分隔,這些均為植物Ⅱ型金屬硫蛋白的典型特征。蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與雙子葉豆科植物田菁關(guān)系最近。(2)生長(zhǎng)曲線測(cè)定和平板菌落分析結(jié)果顯示,FtMT2過表達(dá)的大腸桿菌TOP10和釀酒酵母分別對(duì)Cu2+和Cd2+耐受性增加。暗示FtMT2在苦蕎對(duì)Cu2+和Cd2+的耐受性中發(fā)揮作用。(3)FtMT2重組蛋白的羥自由基去除能力測(cè)定結(jié)果顯示,羥自由基去除率為50%時(shí)的蛋白濃度為46.5μg/m L。暗示FtMT2在苦蕎氧化脅迫耐受性中發(fā)揮作用。(4)通過Genome walking技術(shù)克隆得到了2.1 kb的FtMT2啟動(dòng)子,順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,該啟動(dòng)子區(qū)域脫落酸響應(yīng)元件(abscisic acid responsive element,ABRE)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(methyl jasmonate responsive element,MeJa-RE)、熱休克響應(yīng)元件(heat stress responsive element,HSE)以及參與光響應(yīng)的“ATCT-motif”、“TCT-motif”“GATA-motif”和“I-box”等。特別指出的是,該序列中存在3個(gè)金屬響應(yīng)元件相似序列(MRE-like sequence):“5′-TGCAG-3′”,該元件與動(dòng)物MTs基因啟動(dòng)子上參與重金屬響應(yīng)的元件相似。(5)啟動(dòng)子活性分析結(jié)果顯示,在無Cu2+處理?xiàng)l件下,不同截短體都具有啟動(dòng)子活性,暗示FtMT2基因具有一定的本底表達(dá);在Cu2+處理?xiàng)l件下,不同截短體的啟動(dòng)子活性均顯著上調(diào),其中包含3個(gè)金屬響應(yīng)元件(MRE)的2.1 Kb截短體(FtMT2PR1)和2個(gè)MRE的1.6 Kb截短體(FtMT2PR2)啟動(dòng)子活性分別提高了6.38倍和6.15倍,含有1個(gè)MRE的1.4 Kb截短體(FtMT2PR3)啟動(dòng)子活性提高了3.01倍,而不含預(yù)測(cè)的金屬響應(yīng)元件的0.98 Kb截短體(FtMT2PR4)啟動(dòng)子活性也增加1.81倍。結(jié)果說明預(yù)測(cè)的金屬響應(yīng)元件可能存在劑量效應(yīng),并且在啟動(dòng)子序列中還存在其它重要的金屬響應(yīng)元件響應(yīng)于Cu2+的處理。成功構(gòu)建了1.6 kb啟動(dòng)子及MRE突變體-gus報(bào)告基因的植物表達(dá)載體,并篩選到了T1代陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株,為確定FtMT2的金屬響應(yīng)元件奠定了基礎(chǔ);同時(shí)為構(gòu)建重金屬響應(yīng)的報(bào)告系統(tǒng)提供基礎(chǔ)的元件。(6)成功構(gòu)建pCAMBIA3301-FtMT2過表達(dá)載體,并篩選到陽性的擬南芥T2代轉(zhuǎn)基因植株,為研究FtMT2在植物體內(nèi)的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。以苦蕎植株葉片為材料,采用農(nóng)桿菌注射法進(jìn)行GFP蛋白的瞬時(shí)表達(dá),結(jié)果顯示有較強(qiáng)的熒光信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)首次通過實(shí)驗(yàn)證明,在蕎麥上使用葉片注射的方法進(jìn)行基因的瞬時(shí)表達(dá)是可行的,該研究為蕎麥基因的瞬時(shí)表達(dá)研究提供一條新的途徑。
[Abstract]:Metallothionein (metallothioneins, MTs) is a low molecular weight protein cysteine rich, play an important role in plant resistance to heavy metals. Buckwheat (Fagopyrum tataricum) rich in flavonoids, is an important medicinal and edible crops, which is barren, resistance and good resistance to heavy metal. But at present so far, there are still no reports about the heavy metal tolerance mechanism of tartary buckwheat and buckwheat metallothionein expression regulation and function. This study through cloning of buckwheat type II metallothionein gene sequence (FtMT2), constructed the over expression of FtMT2 in Escherichia coli, yeast and Arabidopsis, hydroxyl radical and determination of the recombinant protein removal ability FtMT2, in order to reveal the function of heavy metal tolerance in buckwheat; through the cloning of FtMT2 promoter sequences, predicted cis elements in the promoter region, constructing two different truncated promoter. Luciferase reporter vector, using the instantaneous response transformation of buckwheat mesophyll protoplast of FtMT2 promoter of Cu2+, in order to reveal the response model of.FtMT2 cloning of FtMT2 gene promoter activity and functional analysis of the promoter has a reference value for the establishment of Cu2+ pollution detection technology, and laid the foundation for the analysis of the intrinsic mechanism of buckwheat heavy metal resistance. The main results and conclusions are: (1) FtMT2 gene contains 3 exons and 2 introns and the intron boundaries conforms to the "5 '-GT' and 'AG-3'" rule.FtMT2 encoding region is 237 BP, encoding 78 amino acids; molecular weight prediction encoding protein is 7.885 kD and isoelectric point of 4.55. The protein sequence contains 14 Cys, containing C-C, C-X-C on the N- side, C-X-X-C motif and a highly conserved sequence, C- "MSCCGGNCGCGS" ends with 3 "C-X-C" motif.N- And the structure of C- terminal separated connection region of 42 amino acids, these are typical characteristics of plant type 2 metallothionein. Protein sequence analysis showed that the system developed recently and dicotyledonous legume Sesbania. (2) determination of growth curve and plate colony analysis showed that over expression of FtMT2 in Escherichia coli coli TOP10 and Saccharomyces cerevisiae respectively for Cu2+ and Cd2+ increased tolerance. Suggesting that FtMT2 play a role in buckwheat tolerance to Cu2+ and Cd2+. (3) the determination of hydroxyl radicals in FtMT2 recombinant protein removal ability showed that hydroxyl radical removal rate is 50% when the protein concentration was 46.5 g/m L. suggested that FtMT2 stress play the role of tolerance in buckwheat oxidation. (4) through the Genome walking technology cloned 2.1 KB FtMT2 promoter cis element prediction results showed that the promoter region of abscisic acid responsive elements (abscisic acid responsive e Lement, ABRE), methyl jasmonate (methyl jasmonate responsive element response element, MeJa-RE), heat shock response element (heat stress responsive element, HSE) and involved in the light response of "ATCT-motif", "TCT-motif" and "GATA-motif" and "I-box". In particular, there are 3 similar metal responsive element the sequence of (MRE-like sequence): "the 5 '-TGCAG-3'", the element and animal MTs gene promoter in heavy metal response elements. (5) promoter activity analysis showed that in the absence of Cu2+ treatment under the condition of different truncated has promoter activity, suggesting that FtMT2 gene has a certain the expression of Cu2+ in the bottom; processing conditions, different truncated promoter activity were significantly up-regulated, which contains 3 metal responsive element (MRE) 2.1 truncated Kb (FtMT2PR1) and 2 MRE 1.6 truncated Kb (FtMT2PR2) The promoter activity was increased by 6.38 times and 6.15 times, with 1.4 truncated Kb 1 MRE (FtMT2PR3) promoter activity was 3.01 times higher than that without prediction of metal responsive element 0.98 truncated Kb (FtMT2PR4) promoter activity increased 1.81 times. The results show that the prediction of metal response element there may be a dose effect, and also have the response processing element in response to Cu2+ other important metal in the promoter sequence. Successfully constructed 1.6 KB promoter and MRE mutant -gus gene plant expression vector and screened positive T1 generation of transgenic Arabidopsis plants, to determine the FtMT2 metal response element basis at the same time; provide the basis for constructing the system response to the report of heavy metal elements. (6) the successful construction of pCAMBIA3301-FtMT2 expression vector, and screened positive Arabidopsis T2 transgenic plants, for the study of FtMT2 in plants Laid the foundation for the in vivo biological function. In Tartary Buckwheat plants leaves as material, transient expression of GFP protein was evaluated by Agroinfiltration, showed a strong fluorescence signal. This is the first time through the experiments prove that the method used in the injection of buckwheat leaf gene expression is feasible. The research provides a a new way for the study of transient buckwheat gene expression.

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：X173;Q943.2

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本文編號(hào)：1506121