本文關(guān)鍵詞： 油桐 KASⅡ基因 克隆 原核表達(dá) Southern雜交　出處：《中南林業(yè)科技大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：油桐是我國原產(chǎn)的古老樹種,與油茶、烏桕、核桃并稱為我國的四大木本油料作物,是具有代表性的經(jīng)濟(jì)林樹種,有重要的經(jīng)濟(jì)價值。油桐通過植物脂類的生物合成途徑將合成的油脂貯存于種子中。KAS全稱全β-酮脂酰-ACP合酶,主要有3類,KAS Ⅰ、KASⅡ、K4SⅢ,在植物油脂的生物合成途徑中,KAS基因家族起到關(guān)鍵性的作用,他們啟動脂肪酸合成、參與決定脂肪酸的碳鏈結(jié)構(gòu),是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶。KASⅡ在此過程中,具有增長碳鏈,決定C16增長為C18的功能,該過程不可逆,也是脂肪酸合成過程中的限速步驟。本研究對油桐KASⅡ基因進(jìn)行克隆和表達(dá)的研究,對探索油桐脂肪合成的分子機(jī)制具有重要意義。本研究的主要結(jié)果如下:1、油桐KASⅡ基因的cDNA全長克隆,擴(kuò)增得到903bp的序列,設(shè)計3'RACE及5'RACE引物進(jìn)行RACE擴(kuò)增,分別獲得1124和1086bp的序列,得到完整的2064bp的cDNA序列。利用ORF Finder查找其編碼區(qū),得到1701bp的CDS序列并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測,得到該蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)。分析該蛋白質(zhì)序列,獲得其基本理化性質(zhì)及其在細(xì)胞中的分布情況。2、油桐基因組提取與Sourthern blot檢測。提取油桐種子基因組,根據(jù)已知的KASⅡ基因序列設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳回收后單酶切該片段,得到帶有酶切位點(diǎn)的目的片段。將該片段轉(zhuǎn)膜固定后與探針雜交、免疫檢測,結(jié)果表面KASⅡ基因在油桐種子基因組中至少有兩個拷貝。3、油桐KASⅡ基因CDS序列克隆及原核表達(dá)。利用PCR擴(kuò)增得到的CDS片段,連接pMD18克隆載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,獲得CDs的克隆。根據(jù)已獲得的油桐KASⅡ基因CDS序列,設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)的引物,擴(kuò)增重組克隆質(zhì)粒。得到大量重組質(zhì)粒后進(jìn)行酶切,回收目的片段并將其與酶切后的表達(dá)載體pGEX-4t-1連接,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Rosseta。獲得大量表達(dá)載體后通過涂平板、PCR、酶切驗(yàn)證其陽性。對正確轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)成功后得到大小約為75KDa的特異條帶,其誘導(dǎo)表達(dá)的合適條件為:18℃、220rpm、IPTG濃度為0.5mM誘導(dǎo)4小時。4、油桐KASⅡ蛋白的分析及純化。誘導(dǎo)得到KASⅡ基因的表達(dá)蛋白后,破碎菌體細(xì)胞,得到細(xì)胞懸液,對上清液和蛋白沉淀分別進(jìn)行PAGE電泳,分析蛋白的可溶性。結(jié)果表明該蛋白在沉淀中有特異條帶,即其表達(dá)形式為包涵體沉淀。對沉淀進(jìn)行洗滌,除去其表面糖類、線粒體DNA、其他表達(dá)蛋白等雜質(zhì)后獲得純凈的表達(dá)蛋白。通過本研究,獲得了油桐KA4SⅡ基因的完整序列,明確了油桐KASⅡ的表達(dá)條件及其蛋白性質(zhì),為后期該基因的深入研究及蛋白質(zhì)的功能研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Taulownia is an ancient tree species native to China. It is regarded as the four largest woody oil crops in China, along with Camellia oleifera, Sapium sebiferum and walnut, and is a representative economic forest tree species. It has important economic value. The synthesized oil is stored in seeds by the biosynthesis of plant lipids. KAS is the whole 尾 -ketolidyl-ACP synthase, and there are three kinds of KAS 鈪，

本文編號：1497722