發(fā)布時間：2018-02-09 00:53

  本文關(guān)鍵詞： 海馬神經(jīng)元 原代培養(yǎng) 慢病毒 AP4M1 AMPA受體　出處：《鄭州大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的原代培養(yǎng)胎鼠海馬神經(jīng)元,并轉(zhuǎn)染包裝了沉默銜接蛋白復合物-4μ亞基(adaptor-related protein complex 4,mu 1 subunit;AP4M1)基因的慢病毒后,觀察細胞AP4M1、GluR1及GluR2(AMPA受體)的表達變化,以探究AP4M1可能介導的AMPA受體運輸變化的分子機制。材料及方法本課題將原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)作為實驗對象,應用免疫熒光來標記神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specifice nolase,NSE),來鑒定所培養(yǎng)細胞中神經(jīng)元的純度。細胞培養(yǎng)中進行慢病毒(沉默AP4M1基因)轉(zhuǎn)染,并進行熒光檢測,以鑒定轉(zhuǎn)染效率,實驗分組:陰性慢病毒轉(zhuǎn)染組及陽性慢病毒轉(zhuǎn)染組(AP4M1基因表達沉默)。分別應用Real-time PCR和Western blotting方法研究AP4M1、GluR1及GluR2的mRNA及蛋白水平的表達變化。結(jié)果1、海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)、鑒定及轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的SD大鼠胎鼠的海馬神經(jīng)細胞生長良好,在種植后第7天神經(jīng)元基本發(fā)育成熟,神經(jīng)元免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示所培養(yǎng)細胞中的神經(jīng)元純度大于95%。在培養(yǎng)第2天可行慢病毒的轉(zhuǎn)染,在轉(zhuǎn)染8-12小時后換液,并于72小時后重復轉(zhuǎn)染1次,再轉(zhuǎn)染8-12h,72小時后進行熒光檢測,轉(zhuǎn)染率大于85%。2、海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染慢病毒后AP4M1、GluR1及GluR2的表達變化1)Real-time PCR檢測:陽性病毒組AP4M1 mRNA表達量較陰性病毒組顯著下調(diào)(t=68.193,P0.01,n=8);轉(zhuǎn)染后GluR1、GluR2 mRNA表達量較陰性病毒組也明顯下降(t=8.060,P0.01,n=8);(t=8.154,P0.01,n=8)。2)Western blot檢測:轉(zhuǎn)染陽性病毒后AP4M1、GluR1及GluR2蛋白表達量較陰性病毒組顯著下調(diào)(F=7.566,t′=15.966,P0.01,n=8),(F=0.408,t′=8.690,P0.01,n=8)(F=5.560,t′=13.770,P0.01,n=8)。結(jié)論海馬神經(jīng)元在轉(zhuǎn)染了包埋沉默AP4M1基因的慢病毒后,AP4M1的mRNA和蛋白表達明顯下調(diào),說明轉(zhuǎn)染有效,進而海馬神經(jīng)元的GluR1、2的mRNA和蛋白表達也明顯下調(diào);AP4M1可能直接或間接調(diào)控海馬神經(jīng)元中的GluR1、2的轉(zhuǎn)運。
[Abstract]:The purpose of primary cultured hippocampal neurons of fetal rats, and transfected the silence adaptor protein complex -4 subunit (adaptor-related protein complex 4, mu 1 subunit; AP4M1) lentivirus, AP4M1 and GluR1 were observed, GluR2 (AMPA receptor) expression and molecular mechanism of changes of AMPA receptor mediated transport to explore AP4M1. Materials and methods in this study, primary cultured hippocampal neurons as the experiment object, using immunofluorescence labeled neuron specific enolase (neuron-specifice nolase, NSE), to identify the cultured cells. The purity of neurons in cell culture (lentivirus silencing AP4M1 gene transfection), and fluorescence detection, to identify the transfection efficiency of lentivirus transfected experimental groups: negative group and positive group (transfected with lentiviral AP4M1 gene silencing). Real-time and Western were used to study the PCR blotting method AP4 M1, mRNA expression and protein level of GluR1 and GluR2. The results of 1 cultured hippocampal neurons, hippocampal neurons of SD fetal rat identification and transfection of primary culture grew well at seventh days after planting basically mature neurons, neurons were detected by immunofluorescence staining showed that the purity of cultured neuronal cells more than 95%. in transfected cultured second days feasible lentivirus was replaced, in 8-12 hours after transfection, and in 72 hours after transfection and then repeated 1 times, 72 hours after the transfection of 8-12h, fluorescence detection, transfection rate is more than 85%.2, hippocampal neurons transfected with lentiviral AP4M1 expression of GluR1 and GluR2 1 Real-time) detection of PCR virus group AP4M1: the positive expression of mRNA virus group significantly decreased compared to negative (t=68.193, P0.01, n=8); GluR1 after transfection, GluR2 mRNA expression was negative in virus group decreased significantly (t=8.060, P0.01, n=8 (t=8.154, P0.01), N=8).2 Western) blot detection: transfection positive virus AP4M1, significantly reduced the amount of virus group compared with the negative expression of GluR1 and GluR2 proteins (F=7.566, t '=15.966, P0.01, n=8), (F=0.408, t' =8.690, P0.01, n=8) (F=5.560, t '=13.770, P0.01, n=8). Conclusion the sea horse the embedding of AP4M1 gene silencing in neurons transfected with lentivirus, mRNA and protein expression of AP4M1 was significantly reduced, indicating effective transfection, and the expression of mRNA and protein in hippocampal neurons of GluR1,2 also significantly decreased; AP4M1 may directly or indirectly regulate hippocampal neurons in the translocation of GluR1,2.

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742

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本文編號：1496690