本文關(guān)鍵詞： 鼻咽癌 外泌體 miR-20a BCL2L11 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞　出處：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:相關(guān)研究表明,鼻咽癌中腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體中有大量微小RNA(microRNA,簡(jiǎn)稱miRNA),其中有一些是顯著上調(diào)的,本研究擬借助生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件對(duì)上述miRNA的可能靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè),并研究是否有相應(yīng)的miRNA和對(duì)應(yīng)靶基因參與了在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的凋亡過(guò)程,并對(duì)其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行初步探索。方法:通過(guò)生物信息學(xué)方法確定目標(biāo)mi RNA及其靶基因,先使用TargetScan、MicroCosm和miRTarBase三個(gè)在線分析數(shù)據(jù)庫(kù),預(yù)測(cè)即有研究證實(shí)了的在鼻咽癌中表達(dá)顯著上調(diào)的mi RNA的靶mRNA;從預(yù)測(cè)結(jié)果中找出三個(gè)軟件預(yù)測(cè)的交集;再借助UniProt在線數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出與凋亡功能相關(guān)的候選靶mRNA及對(duì)應(yīng)的mi RNA;最后利用miRanda在線數(shù)據(jù)庫(kù)/軟件預(yù)測(cè)miRNA-mRNA的相互作用位點(diǎn)。之后分離鼻咽癌患者血清及鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體,先通過(guò)電鏡成像確認(rèn)是否有外泌體被成功分離聚集;再通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外泌體內(nèi)候選miRNA的表達(dá)量;然后使用按前述方法獲得的外泌體處理原代培養(yǎng)的健康志愿者的外周血巨噬細(xì)胞,并觀察這些細(xì)胞是否攝取了外泌體以及攝取外泌體后其凋亡指數(shù)的變化和凋亡通路相關(guān)蛋白量的變化。最后,在體外應(yīng)用miR-20a的擬似物及抑制物轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞。對(duì)上述干預(yù)后的巨噬細(xì)胞進(jìn)行凋亡指數(shù)以及凋亡通路相關(guān)蛋白定量檢測(cè)。結(jié)果:經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):鼻咽癌患者血清或者鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)基中表達(dá)顯著上調(diào)的mirna中mir-20a與凋亡有最密切的關(guān)系,其與凋亡有關(guān)的候選靶基因?yàn)閎cl2l11和casp2基因(分別編碼bim和caspase-2)。經(jīng)透射電鏡成像證實(shí),從鼻咽癌患者的血清以及5-8f細(xì)胞的培養(yǎng)基中均可以分離出豐富的外泌體,這些外泌體可以被體外原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞大量吞噬。被來(lái)自5-8f細(xì)胞培養(yǎng)基和鼻咽癌患者血清提取的外泌體處理的巨噬細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著低于用空白對(duì)照組、np69細(xì)胞培養(yǎng)基和健康志愿者血清提取的外泌體處理的巨噬細(xì)胞。使用westernblot定量檢測(cè)caspase-2蛋白和bim蛋白發(fā)現(xiàn):caspase-2蛋白在各組間無(wú)顯著差異;5-8f細(xì)胞培養(yǎng)基和鼻咽癌患者血清提取的外泌體處理的巨噬細(xì)胞的bim蛋白顯著少于其他組。使用實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)外泌體內(nèi)mir-20a的表達(dá)發(fā)現(xiàn):來(lái)自5-8f細(xì)胞培養(yǎng)基提取的外泌體中的mir-20a含量顯著高于np69細(xì)胞培養(yǎng)基提取的外泌體中的mir-20a含量;由鼻咽癌患者血清提取的外泌體中的mir-20a的含量顯著高于健康志愿者血清提取的外泌體中的mir-20a含量。利用mir-20a擬似物及抑制物轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn):相對(duì)于對(duì)照組,mir-20a擬似物組的凋亡指數(shù)顯著減少;而相對(duì)于對(duì)照組,抑制物組的凋亡指數(shù)沒(méi)有顯著差別。相對(duì)于對(duì)照組,mir-20a擬似物組的bim蛋白含量顯著減少;而相對(duì)于對(duì)照組,抑制物組的bim蛋白沒(méi)有顯著差別。相對(duì)于對(duì)照組,mir-20a擬似物組的caspase-9蛋白含量顯著減少;而相對(duì)于對(duì)照組,抑制物組的caspase-9蛋白沒(méi)有顯著差別。相對(duì)于對(duì)照組,mir-20a擬似物組的caspase-3蛋白含量顯著減少;而相對(duì)于對(duì)照組,抑制物組的caspase-3蛋白沒(méi)有顯著差別。結(jié)論:本研究證明了鼻咽癌細(xì)胞可以過(guò)表達(dá)miR-20a,而且可以經(jīng)過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移進(jìn)入巨噬細(xì)胞,進(jìn)而抑制其凋亡。其機(jī)制是miR-20a抑制了Bim-Caspase-9-Casepase-3凋亡途徑的活化。
[Abstract]:Objective : To study the apoptosis of tumor - related macrophages in nasopharyngeal carcinoma ( NPC ) by means of bioinformatics , and to investigate whether there are corresponding miRNA and target genes involved in the growth , invasion and metastasis of nasopharyngeal carcinoma . Conclusion : The mechanism is that miR - 20a inhibits the activation of the apoptosis pathway of Bim - Caspase - 9 - Casepase - 3 .

【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：1494702