本文關(guān)鍵詞： 乳腺癌 過氧化物酶體增殖物激活受體delta(PPARδ) 葡萄糖剝奪 氧化應(yīng)激 AKT PPARδ拮抗劑　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的:致死性乳腺癌細胞其新陳代謝具有殺傷正常細胞而使自身存活的特點。此特點可引起其對化療及免疫治療的抵抗,而最終成為難以治愈的癌癥。針對這種讓乳腺癌細胞可以在惡劣生存環(huán)境下存活的機制,目前我們發(fā)現(xiàn)一種更好的治療靶點,也許可以成為新的特異性靶向治療,從而改善治療效果。細胞核受體——過氧化物酶體增殖物激活受體delta(PPARδ)是一種可以讓癌細胞在惡劣生存環(huán)境下茁壯成長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。PPARδ是核受體PPAR家族的一員,這其中還包括PPARα和PPARγ,PPARδ可調(diào)控脂肪細胞中的脂肪儲備以及肝臟和肌肉中的脂肪酸氧化。PPARδ的表達是普遍存在的,但當(dāng)配體缺失或結(jié)合輔阻遏物(如NCo R1或去乙酰組蛋白)時可抑制其表達。它可以被高濃度游離脂肪酸、具有生物活性的脂質(zhì)以及人工合成激動劑(GW501516、GW0742)激活。隨著配體結(jié)合,PPARδ構(gòu)象發(fā)生變化,繼而介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄(如PPARD本身、ANGPTL4、抗氧化基因CAT等),這些也是PPARδ被激活的標志。PPARδ可通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)和防止細胞分裂來增加骨骼肌耐力及阻止造血干細胞消耗。在這種氧化應(yīng)激的條件下,細胞可在逐漸惡化的環(huán)境中保持相對長時間的存活。如果在癌細胞中PPARδ可以像在肌肉或干細胞中那樣被活化,那么它也許也會在這種應(yīng)激的代謝環(huán)境中繼續(xù)生長,這也是浸潤性癌癥的特點之一。我們已經(jīng)證實了,在白血病細胞中,當(dāng)糖酵解被抑制時,PPARδm RNA和蛋白表達上調(diào)。本文我們將研究乳腺癌在不利條件下(固體腫瘤微環(huán)境)PPARδ的作用,為其在今后臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。方法:為了明確PPARδ在乳腺癌中的作用,我們利用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒感染,建立PPARδ過表達及敲除乳腺癌細胞模型,并給予相應(yīng)激動劑與拮抗劑進行干預(yù),觀察乳腺癌細胞在低糖、缺氧等不利生存條件下細胞的增殖及生存能力。通過免疫印跡方法和實時熒光定量PCR測定PPARδ相關(guān)蛋白和基因的表達。通過7AAD與DCFH染色流式細胞術(shù)測定細胞凋亡及ROS水平。通過Transwell細胞侵襲實驗觀察體外細胞遷徙能力。最后通過小鼠乳腺癌模型的建立,觀察乳腺癌細胞在體內(nèi)的生長與轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果:我們通過一組公共數(shù)據(jù)獲知乳腺癌患者的生存率與PPARδ的表達相關(guān),隨后我們建立了大鼠乳腺癌細胞模型,發(fā)現(xiàn)癌細胞的快速生長(體外與體內(nèi))也與PPARδ的高表達有關(guān)。我們又將PPARD基因轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細胞株MCF-7與SKB-R3,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了PPARδ的人乳腺癌細胞株具有快速遷徙(體外)與增加腫瘤轉(zhuǎn)移(體內(nèi))的特點,而且PPARδ可以在營養(yǎng)匱乏的培養(yǎng)基中繼續(xù)良好生長。之后我們又將人乳腺癌細胞株置于低濃度葡萄糖或其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激環(huán)境下(如缺氧),通過7AAD染色流式細胞術(shù)分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了PPARD基因的人乳腺癌細胞株可以更好的存活。之后我們應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或人工合成激動劑上調(diào)PPARδ表達同樣可以使野生型MCF-7細胞在低糖環(huán)境下繼續(xù)存活。DCFH染色流式細胞分析提示低糖環(huán)境下,高表達PPARδ細胞具有較高的抗氧化應(yīng)激能力,從而提高乳腺癌細胞的生存率,隨后給予對照組細胞過氧化氫酶處理也可增加其生存率。蛋白免疫印跡試驗表明在低糖環(huán)境中高表達PPARδ細胞具有更高表達的遲發(fā)性AKT的磷酸化(葡萄糖剝奪后延長生存信號反應(yīng)),進而延長乳腺癌細胞生存時間,同時給予胰島素或干擾素α于對照組細胞增加AKT水平同樣可增加其生存率,相反給予AKT抑制劑IV于PPARD高表達細胞可降低其生存率。最后應(yīng)用人工合成PPARδ抑制劑,可以逆轉(zhuǎn)這種PPARδ所產(chǎn)生的生存優(yōu)勢,這個逆轉(zhuǎn)結(jié)果還可被其激動劑還原。結(jié)論:1、PPARδ可以通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)乳腺癌細胞在惡劣代謝環(huán)境中的生存率;2、PPARδ可以通過增強生存信號(p-AKT)調(diào)節(jié)乳腺癌細胞在惡劣代謝環(huán)境中的生存率;3、小分子抑制劑可以逆轉(zhuǎn)PPARδ在乳腺癌中的保護作用;4、PPARδ可作為一種新的治療靶點,為乳腺癌的治療提供新的思路及方法。
[Abstract]:Background and purpose: fatal breast cancer cells and normal cells with the The new supersedes the old. the characteristics of their own survival. This characteristic can cause the resistance to chemotherapy and immunotherapy, and eventually become difficult to cure cancer. The mechanism of this that breast cancer cells can survive in the harsh environment, we found that the current therapeutic target a little better, may become the new targeting therapy, so as to improve the therapeutic effect. Nuclear receptor, peroxisome proliferator activated receptor delta (PPAR delta) is one of the key can make cancer cells thrive in the harsh environment under the regulatory factor.PPAR delta is a member of the nuclear receptor of the PPAR family, the including PPAR and PPAR expression of alpha gamma, PPAR Delta.PPAR delta can be fatty acid oxidation regulation in fat cells and fat reserves in liver and muscle is common, but When combined with ligand deletion or corepressor (such as NCo or R1 deacetylates histones) can inhibit its expression. It can be a high concentration of free fatty acids, bioactive lipids and synthetic agonists (GW501516, GW0742). With the activation of ligand binding, PPAR delta conformation occurs changes, then mediated transcription of genes (such as PPARD itself, ANGPTL4, CAT, antioxidant genes) are also activated PPAR Delta.PPAR delta sign can reduce oxidative stress and prevent cell division to increase muscle endurance and prevent the consumption of hematopoietic stem cells. In this oxidative stress conditions, cells can maintain a relatively long time survival in the deteriorating environment. If the cancer cells PPAR 8 can be like in muscle or stem cells that are activated, then perhaps it will continue to grow in the metabolism of environmental stress, which is characteristic of invasive cancer One. We have confirmed that in leukemia cells, when glycolysis was inhibited, up-regulated expression of PPAR delta m RNA and protein. In this paper, we will study on breast cancer under adverse conditions (solid tumor microenvironment) PPAR delta function, as in the future clinical application. Methods: in order to effect clear PPAR 8 in breast cancer, we use retroviral and lentiviral infection, the establishment of PPAR 8 overexpression and knockout breast cancer cell model, and give the corresponding agonist and antagonist intervention, observed in low sugar breast cancer cell proliferation and viability of cells in hypoxia disadvantageous living conditions. The determination of the expression of PPAR related proteins and genes by Western blot and real-time quantitative PCR. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis by 7AAD staining and the level of ROS and DCFH. Through the Transwell cell invasion in vitro cell migration ability. Finally, through the establishment of a mouse model of breast cancer, breast cancer cell growth and metastasis in vivo. Results: our ability through the expression of survival rate and PPAR 8 a common set of data that patients with breast cancer related, then we established a rat model of breast cancer cells, the rapid growth of cancer cells in vitro and (in the high expression of PPAR) and 8. We will PPARD gene transfected into human breast cancer cell lines MCF-7 and SKB-R3 showed that the transfected PPAR 8 human breast cancer cell line with rapid migration (in vitro) and tumor metastasis (in vivo) characteristics, and can continue to grow well in PPAR Delta medium the lack of culture nutrition. Then we will be human breast cancer cell lines in a low concentration of glucose or other endoplasmic reticulum stress environment (such as hypoxia), flow cytometry analysis by 7AAD staining, found PPARD transfected human breast Survival can be better cancer cells. Then we use of corticosteroids or synthetic agonists up-regulated PPAR delta also makes the expression of wild type MCF-7 cells in low sugar environment to survive.DCFH staining and flow cytometry analysis indicated that a low sugar environment, high expression ability of PPAR delta cells have higher oxidative stress, so as to improve the survival the rate of breast cancer cells, then the cells of control group were given treatment with catalase can increase the survival rate. Western blotting test showed that the high expression of PPAR delta cells with higher expression of delayed phosphorylation of AKT in low sugar environment (the survival signal response after glucose deprivation) and prolong the survival of cancer cells, breast time, while giving insulin or interferon alpha increased AKT levels in the control group cells also can increase the survival rate, instead given AKT inhibitor IV in PPARD high expression cell can be reduced The survival rate. Finally, the application of synthetic inhibitor of PPAR Delta, Delta PPAR can reverse the resulting survival advantage, the results can be reversed by the agonist reduction. Conclusion: 1, PPAR 8 can lower survival rates of breast cancer by regulating cell metabolism in harsh environment in response to oxidative stress; 2, PPAR can. By enhancing the survival signal (p-AKT) in breast cancer cell survival rate in severe metabolic environment; 3, small molecule inhibitors can protect the reversal effect of PPAR 8 in breast cancer; 4, PPAR 8 can be used as a new therapeutic target, to provide new ideas and methods for the treatment of breast cancer.

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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