本文關(guān)鍵詞： 先天發(fā)育異常 地區(qū) 性別 母孕期年齡 神經(jīng)管缺陷 新生兒 腦損傷 風(fēng)險(xiǎn)因素 不良結(jié)局 隨訪 腦性癱瘓 自噬相關(guān)基因 單核苷酸多態(tài)性 ATG5 ATG7 腦性癱瘓 熒光素酶報(bào)告基因 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)錄活性 ATG7　出處：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是通過受基因調(diào)控的神經(jīng)發(fā)生、細(xì)胞分化及遷徙等多個(gè)復(fù)雜過程而實(shí)現(xiàn)的并受母孕期環(huán)境因素的影響,相關(guān)基因的功能異常或者母親孕期高危因素的存在可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常,包括胎兒或者新生兒神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)或者結(jié)構(gòu)的異常,如腦積水、神經(jīng)管畸形等,以及出生后需要進(jìn)一步的生化或者功能檢查才能確定是否存在功能發(fā)育異常,如智力障礙、腦癱等,這些神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)以及功能發(fā)育異常是最嚴(yán)重的先天性出生缺陷,目前的預(yù)防和治療手段遠(yuǎn)未達(dá)到臨床實(shí)際需求。我國每年約2000萬新生兒出生,其中先天發(fā)育異常兒有60萬左右。在發(fā)育異常的新生兒中,神經(jīng)管缺陷是較為常見的形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常,我國每年有2億元用于這些患兒的救治。功能異常的神經(jīng)發(fā)育不良患兒數(shù)量遠(yuǎn)高于神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)和結(jié)構(gòu)的發(fā)育異常,由于不易早期識(shí)別,潛在危害以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)更加嚴(yán)重。自吞噬在腦的正常發(fā)育過程中起重要的作用,大量的新生細(xì)胞因未建立起功能連接而以自吞噬或者凋亡的方式被清除,以保持大腦的形態(tài)結(jié)構(gòu)正常發(fā)育。自吞噬在損傷因素的作用下被廣泛激活,以清除大量壞死細(xì)胞,減少炎癥反應(yīng),但是過度的自吞噬可以導(dǎo)致胞漿及細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能破壞,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,因此自吞噬具有維持細(xì)胞存活和導(dǎo)致細(xì)胞死亡的雙重作用。自噬相關(guān)基因5和自噬相關(guān)基因7(ATG5和ATG7)是參與自噬體形成的重要成員,可能進(jìn)一步影響相關(guān)基因的功能表達(dá),但是有關(guān)于atg5和atg7基因的多態(tài)性與腦性癱瘓的關(guān)系尚未見報(bào)道。腦癱是目前導(dǎo)致我國兒童致殘的首位原因,全國現(xiàn)有200萬以上腦癱患兒需要康復(fù)治療,其中有31萬例學(xué)齡前腦癱患兒,并以每年4.6萬的速度遞增,嚴(yán)重影響了我國人口素質(zhì)的提高。但是腦癱的發(fā)病病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,越來越多的證據(jù)顯示遺傳因素在腦癱的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究首先通過臨床患兒的流行病學(xué)研究調(diào)查圍產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育現(xiàn)況的動(dòng)態(tài)變化以及影響的因素,而后以導(dǎo)致兒童傷殘首位原因的腦癱為研究對(duì)象進(jìn)行臨床大樣本的實(shí)驗(yàn)分析,探討自噬相關(guān)基因在腦癱患兒發(fā)生發(fā)展中的作用,為圍產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育異常和腦癱的防治提供理論基礎(chǔ)。第一部分以人群為基礎(chǔ)圍產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育現(xiàn)狀的流行病學(xué)研究第一節(jié)先天發(fā)育異常流行病學(xué)資料分析目的通過整理收集河南省監(jiān)測(cè)醫(yī)院及監(jiān)測(cè)點(diǎn)內(nèi)住院分娩的所有妊娠滿28周至產(chǎn)后7天內(nèi)圍生兒中的先天發(fā)育異常兒,尤其是神經(jīng)管缺陷的發(fā)生情況,進(jìn)一步分析常見先天發(fā)育異常的發(fā)生率、分布地區(qū)和人群分布等,制定相應(yīng)的預(yù)防措施提供依據(jù)。方法本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)包括河南省從1997年1月1日到2011年12月31日所有監(jiān)測(cè)醫(yī)院及監(jiān)測(cè)點(diǎn)內(nèi)先天發(fā)育異常兒的信息,均經(jīng)體格檢查和其他輔助檢查如超聲、x射線、核磁共振、染色體分析或尸檢等來證實(shí)診斷,確診后填寫《出生缺陷登記卡》,內(nèi)容包括孕齡、性別、母親年齡、居住地、主要診斷及新生兒轉(zhuǎn)歸等。所有信息輸入excel2010表格,轉(zhuǎn)錄入spss17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)生率(%)采用卡方檢驗(yàn),發(fā)生率的趨勢(shì)采用邏輯回歸分析,以p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1.先天發(fā)育異�？偘l(fā)生率15年間,我省檢測(cè)點(diǎn)共收集1 815 920名新生兒,有15 660名圍產(chǎn)兒存在先天發(fā)育異常,平均發(fā)生率為86.24/萬。監(jiān)測(cè)期間農(nóng)村平均發(fā)生率高于城市(χ2=4.023,P=0.045)。Logistic回歸分析顯示,農(nóng)村發(fā)生率呈顯著下降趨勢(shì)(P0.0001),城市發(fā)生率呈增長趨勢(shì),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)�？偟钠骄l(fā)生率呈穩(wěn)步下降狀態(tài),從1997年的109.8/萬到2003年的82.3/萬(χ2=49.06,P0.001),然后保持相對(duì)穩(wěn)定到2011年80.19/萬(χ2=185.29,P0.0001)。15年間農(nóng)村發(fā)生率下降55.2%,城市發(fā)生率上升19.3%。導(dǎo)致整體發(fā)生率下降26.9%。2.亞組分析顯示:(1)男孩平均發(fā)生率為86.43/萬和女孩為83.54/萬(χ2=4.44,P=0.035),男孩略高于女孩。所有監(jiān)測(cè)的人群中,母孕期不同年齡組中,平均發(fā)生率最低的78.2/萬為25到29歲間的組別,最高的為小于20歲組別,發(fā)生率為122.003(χ2=37.545,P0.001);(2)15年間,2007年以前神經(jīng)管缺陷的排名一直位居第一位,2009年以后位居第三位。其1997年發(fā)生率為39.3/萬,到2011年下降到6.1/萬(χ2=388.853,P0.001),下降率達(dá)到84.5%。結(jié)論1.15年間,我省先天發(fā)育異常發(fā)生率呈穩(wěn)步下降狀態(tài)。農(nóng)村顯著下降,城市呈增長趨勢(shì)。2.男性發(fā)生率略高于女性。平均發(fā)生率最低母孕期年齡為25到29歲間,最高為小于20歲組別;3.神經(jīng)管缺陷發(fā)生率呈明顯下降趨勢(shì)。第二節(jié)圍產(chǎn)兒不良神經(jīng)預(yù)后的分析目的采用圍產(chǎn)期出生新生兒及住院患兒資料統(tǒng)計(jì)分析,并對(duì)診斷為新生兒腦損傷的患兒通過隨訪,研究分析其遠(yuǎn)期不良神經(jīng)預(yù)后。方法選擇從2007年1月至2012年12月由我院接診分娩和分娩后住院圍產(chǎn)兒為研究對(duì)象。所有數(shù)據(jù)分層按性別、出生體重、分娩方式、產(chǎn)婦年齡、孕齡,單胎或多胎,妊娠期并發(fā)癥(妊娠期糖尿病,妊高癥,胎膜早破等)等進(jìn)行記錄。所有圍產(chǎn)期新生兒及患兒發(fā)病率均以年為計(jì)算單位,對(duì)腦損傷患兒在其年齡≥1歲后進(jìn)行隨訪(住院病例+電話隨訪+來院復(fù)診)工作。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)比較,多因素采用Logistic回歸分析,統(tǒng)計(jì)OR值及95%可信區(qū)間,均以P0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1.總體分析:6年間我院分娩新生兒中,早產(chǎn)比例從21.4%下降到20.4%(P=0.27),剖宮產(chǎn)發(fā)生率從65.2%下降到62.9%(P=0.029)。1695名住院新生兒被診斷為腦損傷,腦損傷發(fā)病率從17.4%增加到35.1%(P0.001),腦損傷后遺癥的發(fā)生率2.3%上升到3.97%(P=0.443)。2.高危因素分析:(1)新生兒入住NICU高危因素:出生體重風(fēng)險(xiǎn)最大為1000~1499g(OR=3.185,95%CI 2.258-4.491,P0.001),性別(OR=0.854,95%CI 0.778-0.937,P0.001),1分鐘Apgar評(píng)分風(fēng)險(xiǎn)最大為4~7分(OR=4.211,95%CI 3.277-5.412,P0.001)等。(2)腦損傷高危因素:胎齡風(fēng)險(xiǎn)最大為34~36+6 W(OR=1.55,95%CI1.341-1.792,P0.001),1分鐘Apgar評(píng)分風(fēng)險(xiǎn)最大的為4分,不同分娩方式中剖宮產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)最大(OR=1.499,95%CI 1.102-2.038,P=0.01),單胎或多胎(OR=2.051,95%CI 1.821-2.312,P0.001)等。3.住院新生兒中,呼吸系統(tǒng)疾病占34.6%,比例最高,順位第二位的是黃疸,占25.9%,神經(jīng)系統(tǒng)疾病順位第四位占14.8%。4.不同亞組比較分析:(1)腦損傷影像學(xué)結(jié)果分正常,輕度異常,嚴(yán)重異常三組,發(fā)現(xiàn):結(jié)局中腦癱(χ2=13.871,P=0.001),和智力缺陷(χ2=6.332,P=0.042),統(tǒng)計(jì)上有差異。(2)不同胎齡段分早期早產(chǎn)兒,晚期早產(chǎn)兒和足月兒三組。三組住院發(fā)病率、腦損傷發(fā)生率、腦損傷后遺癥發(fā)生率比較,(χ2分別為8551.7,17.28,22.16,P均0.001)。結(jié)論1.剖宮產(chǎn)發(fā)生率呈下降趨勢(shì)。新生兒腦損傷的發(fā)生率趨于上升現(xiàn)象。2.新生兒入住NICU和是否發(fā)生腦損傷的危險(xiǎn)因素不完全相同。3.不同影像學(xué)結(jié)果及不同胎齡腦損傷及后遺癥發(fā)生率不同。第二部分ATG5和ATG7基因多態(tài)性與小兒腦癱的關(guān)聯(lián)性研究目的采用大樣本病例-對(duì)照研究,通過分析腦癱患兒ATG5和ATG7的基因多態(tài)性,在中國漢族人群中探討自噬相關(guān)基因和腦癱易感性之間的關(guān)系。方法本研究選擇715例腦癱患兒為實(shí)驗(yàn)組,同期隨機(jī)選擇658例體檢兒童為對(duì)照組,兩組年齡等基本信息比較均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分別選擇ATG5的5個(gè)SNP位點(diǎn)(rs573775,rs510432,rs6568431,rs2299863和rs3804338);ATG7的6個(gè)SNP位點(diǎn)(rs11706903,rs2606750,rs346078,rs4684787,rs1470612和rs2594972),使用Massarray分型技術(shù)對(duì)兩組進(jìn)行基因分型。使用SHEsis在線軟件進(jìn)行基因數(shù)據(jù)分析,每個(gè)SNP的多重檢驗(yàn)均使用SNPSp D在線系統(tǒng)進(jìn)行校正。以P0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1.總體結(jié)果:ATG5基因的rs6568431位點(diǎn)的基因型及等位基因型頻率在腦癱組和正常對(duì)照組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P值分別為0.0005和0.0015;ATG7基因的rs14706126和rs2594972兩個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型及等位基因型頻率在腦癱組和正常對(duì)照組間比較有差異,P值分別為0.02、0.0004和0.044、0.0012。2.亞組分析顯示:1)性別分析:ATG5基因的rs6568431位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率在男性腦癱組與男性對(duì)照組間存在顯著差異(P=0.005和0.004);ATG7基因的rs1470612和rs2594972位點(diǎn)等位基因及基因型頻率在男性腦癱組和男性對(duì)照組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.02,0.0004,0.044和0.0012);(2)新生兒期并發(fā)癥分析:ATG5基因rs6568431位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率腦癱伴HIE組與對(duì)照組間比較存在顯著差異(P0.0001和P=0.0005);ATG7基因rs2594972位點(diǎn)等位基因頻率在腦癱伴PVL組與對(duì)照組間比較存在差異(P=0.016);同樣rs2594972位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率在腦癱伴HIE組與對(duì)照組間比較存在顯著差異(P均0.0001),伴或不伴HIE的腦癱患兒在位點(diǎn)rs2594972的等位基因頻率和基因型頻率比較存在顯著差異(P均0.0001);(3)腦癱類型分析:ATG7基因的rs1470612,rs2594972位點(diǎn)在痙攣型腦癱和對(duì)照組間比較等位基因頻率和基因型頻率均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,除rs1470612基因型頻率外,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均0.05)。另外,rs11706903、rs4684787、rs1470612和rs2594972位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率在痙攣型雙癱組與對(duì)照組之間除rs4684787處的基因型頻率外都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均0.05);(4)母孕期并發(fā)癥分析:ATG5基因腦癱患兒母孕期是否存在胎膜早破與對(duì)照間比較,rs573775位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率分布存在差異(P=0.015和0.04);ATG7基因腦癱患兒母孕期是否存在胎膜早破與對(duì)照組比較,rs1470612和rs2594972位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率分布存在顯著差異(P均0.05);(5)腦癱伴有合并癥分析:ATG5基因的腦癱患兒伴有智力低下組和不伴有智力低下組分別與對(duì)照組比較,rs6568431位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率分布均存在顯著差異(P=0.015和0.02);(6)其它亞組分組與對(duì)照組間沒有差異(P0.05)。注:以上結(jié)果中所有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的P值均為通過SNPSp D校正后的P值。結(jié)論1.ATG5和ATG7基因多態(tài)性與腦癱的易感性相關(guān);2.ATG5和ATG7基因多態(tài)性與腦癱患兒性別相關(guān),ATG5基因與腦癱患兒伴有PROM和智力低下相關(guān),ATG7基因與腦癱患兒伴HIE和痙攣型雙癱有關(guān)。第三部分腦癱患兒ATG7啟動(dòng)子熒光素酶基因活性的測(cè)定目的采用克隆ATG7基因啟動(dòng)子的方法,插入螢光素酶報(bào)告基因載體,檢測(cè)不同組別熒光素酶表達(dá)量的差異,探討其于小兒腦癱的可能關(guān)系。方法采用細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和luciferase檢測(cè)技術(shù),在工具細(xì)胞293T細(xì)胞(人胚胎腎細(xì)胞)中擴(kuò)增ATG7啟動(dòng)子,插入熒光素酶報(bào)告基因載體p GL3-empty CON080,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,選取不同的SNP位點(diǎn)野生型和突變型,測(cè)定其啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(ATG7的rs1470612和rs2594972位點(diǎn)),并與SV40病毒轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)子活性進(jìn)行比較。使用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,單因素分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,以P0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1.構(gòu)建了ATG7基因不同位點(diǎn)啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因;通過測(cè)序及質(zhì)粒酶切鑒定,所構(gòu)建的ATG7基因的啟動(dòng)子正確;2.活性測(cè)定表明,報(bào)告基因在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞SV40病毒轉(zhuǎn)染后及不同基因位點(diǎn)中顯示構(gòu)建ATG7基因不同啟動(dòng)子活性,并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng);3.ATG7基因的rs1470612和rs2594972位點(diǎn)的熒光素酶檢測(cè)比較,突變型luciferase相對(duì)表達(dá)量均降低,野生型和突變型間存在差異(P0.0001和P=0.009)。結(jié)論ATG7基因突變后熒光素酶表達(dá)量下調(diào),在rs1470612和rs2594972位點(diǎn)發(fā)生基因突變與腦癱疾病存在關(guān)聯(lián)性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742.3
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本文編號(hào)：1492537