本文關(guān)鍵詞： 胃癌 凝集素芯片 特征性聚糖譜 凝集素印跡技術(shù) 胃癌 TMT標(biāo)記技術(shù) 生物信息學(xué)技術(shù) RAGE sRAGE 胃癌 基因多態(tài)性　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分基于凝集素芯片技術(shù)的胃癌血清特征性聚糖譜分析目的 探討胃癌患者與健康對照人群血清糖蛋白聚糖譜差異,建立胃癌特征性血清聚糖譜,為進(jìn)一步尋找胃癌腫瘤標(biāo)志物及胃癌的診斷提供思路和基礎(chǔ)。方法分別收集胃癌患者和健康對照人群血清,采用凝集素芯片技術(shù)檢測血清蛋白聚糖親和信號,并應(yīng)用凝集素印跡技術(shù)驗證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。實驗主要包含以下步驟：(1)分別獲得健康對照組及胃癌組患者的混合血清并去除混合血清中的白蛋白和IgG；(2)獲取的低豐度蛋白經(jīng)除鹽柱轉(zhuǎn)換溶劑體系后采用超濾管提高蛋白濃度；(3)CY5熒光染料標(biāo)記待測蛋白后與凝集素芯片進(jìn)行雜交；(4)熒光掃描儀掃描凝集素芯片熒光信號并提取數(shù)據(jù)；(5)獲取的數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布且滿足方差齊性檢驗的數(shù)據(jù)采用成組設(shè)計兩樣本均數(shù)t檢驗,P0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。不滿足方差齊性檢驗的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗Mann-Whitney秩和檢驗,P0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(6)凝集素印跡技術(shù)檢測LEL、PHA-L、RCA-I和STL四種凝集素對血清糖蛋白的親和能力,驗證凝集素芯片結(jié)果的可靠性。結(jié)果本實驗共篩選出13種與腫瘤相關(guān)的差異凝集素；其中CAL(識別黏蛋白T/Tn抗原)、DSA(識別三、四天線結(jié)構(gòu))、EEL(識別半乳糖(α-1,3)半乳糖結(jié)構(gòu))、LEL(識別N-乙酰氨基葡糖低聚物結(jié)構(gòu))、PWA(識別(GlcNAcβ4) n結(jié)構(gòu))、PHA-L(識別p-1,6分支結(jié)構(gòu))、RCA-I(識別末端Gal β1-4 GlcNAcβ1結(jié)構(gòu))、RCA-Ⅱ(識別N-乙酰半乳糖胺)、STL(識別N-乙酰氨基葡糖低聚物結(jié)構(gòu))、UEA(識別αα連接巖藻糖殘基)和VAL(識別p-D-半乳糖殘基)共11種凝集素在胃癌組中對血清糖蛋白親和力顯著高于健康對照組(P0.05)；而CFL(識別N-乙酰半乳糖胺)和GNL(識別α-1,3甘露糖殘基)兩種凝集素在胃癌組中親和信號顯著低于健康對照組(P0.05)。凝集素印跡技術(shù)證明PHA-L、RCA-I和STL四種凝集素的結(jié)果與凝集素芯片結(jié)果一致。結(jié)論應(yīng)用凝集素芯片技術(shù)成功篩選出13種與血清糖蛋白親和力存在差異的凝集素,建立了胃癌血清糖蛋白特征性聚糖譜,提示血清糖蛋白特征性糖鏈改變與胃癌的發(fā)生密切相關(guān),為進(jìn)一步尋找胃癌腫瘤標(biāo)志物及胃癌的診斷提供思路和基礎(chǔ)。第二部分基于TMT技術(shù)的胃癌血清定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析目的 探討胃癌患者與健康對照人群血清中蛋白差異,并對差異蛋白進(jìn)行篩選,為尋找胃癌血清腫瘤標(biāo)志物提供基礎(chǔ)。方法 胃癌組和健康對照組每組各取10例血清樣品混合,混合血清樣品去除白蛋白和IgG后,經(jīng)PD-10脫鹽柱除鹽。胰酶消化后的肽段進(jìn)行TMT同位素標(biāo)記。TMT標(biāo)記的混合肽段先采用高pH反相液相色譜分離,然后進(jìn)行低pH nano-HPLC-MS/MS分析。根據(jù)質(zhì)譜鑒定的肽段TMT相對定量值,篩選出表達(dá)增加1.2倍或減低0.8倍的差異蛋白；采用生物信息學(xué)分析技術(shù)對差異蛋白進(jìn)行篩選。結(jié)果 胃癌組和健康對照組共鑒定出非冗余蛋白594種蛋白,其中篩選出差異蛋白105種。與健康對照組相比,胃癌組中共48種蛋白表達(dá)上調(diào),57種蛋白表達(dá)下調(diào)。采用生物信息學(xué)相關(guān)工具對差異蛋白進(jìn)行解析后發(fā)現(xiàn),差異蛋白主要集中分布在細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外空間、質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)；生物學(xué)過程集中在介導(dǎo)抗原的結(jié)合、鈣離子結(jié)合、蛋白二聚體活化等；分子功能分類主要負(fù)責(zé)天然免疫、凝血、細(xì)胞代謝過程、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞等。結(jié)論本研究采用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析胃癌患者血清和健康對照人群血清,篩選出胃癌血清的差異蛋白表達(dá)譜,獲得一批潛在的胃癌血清標(biāo)志物,為胃癌的診斷和藥物干預(yù)治療提供了潛在的靶點。第三部分sRAGE血清水平和RAGE基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險目的檢測RAGE基因rs2070600、rs 184003、rs 1800624和rs1800625四個位點的單核苷酸多態(tài)性,并聯(lián)合血清sRAGE水平,探討廣西地區(qū)人群RAGE基因突變與胃癌的發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性。方法 本研究共納入200例胃癌患者和207例健康體檢者,采用PCR-RFLP技術(shù)檢測RAGE基因rs2070600、rs 184003、rs1800624和rs1800625四個位點的單核苷酸多態(tài)性,并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序驗證基因型的準(zhǔn)確性。ELISA法直接檢測血清sRAGE水平。哈-溫平衡檢驗納入的研究對象是否具有群體代表性。采用二元logistic回歸分析方法校正性別、年齡、種族、BMI、家族史、吸煙和飲酒等混雜因素,計算比值比和95%可信區(qū)間,分析血清sRAGE水平和RAGE基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性。結(jié)果1.rs2070600位點和rs184003位點的基因型分布符合哈-溫平衡定律(P值均大于0.05),表明研究對象具有較好的群體代表性。2.rs2070600位點有GG.AG和AA共三種基因型,AG基因型可顯著增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險,其OR=1.62,95%CI=1.03-2.58,P=0.038.聯(lián)合AG+AA基因型(顯性模型)與胃癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)(OR=1.83,95%CI= 1.01-2.39,P=0.0441.AA基因型和G等位基因與胃癌的發(fā)病風(fēng)險無相關(guān)性(P值大于0.05)。上述結(jié)果提示RAGE基因rs2070600位點基因突變增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險。3.rs184003位點有GG.GT和TT共3種基因型,GT基因型與胃癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān),其OR=0.62,95%CI=0-39-0.99,P=0.048.TT基因型、GT+TT聯(lián)合基因型、GT+GG聯(lián)合基因型與胃癌的發(fā)病風(fēng)險無相關(guān)性(P值均大于0.05)。上述結(jié)果提示rs184003位點基因突變降低胃癌的發(fā)病風(fēng)險。4.rs1800624位點有TT.AT和AA共3種基因型, AT基因型、AA基因型、AA+AT聯(lián)合基因型、AT+TT聯(lián)合基因型和A等位基因與胃癌的發(fā)病風(fēng)險無相關(guān)性(P值均大于0.05)。5.rs1 800625位點有CC.CT和TT共3種基因型,CT基因型、TT基因型、CC+CT聯(lián)合基因型、TT+CT聯(lián)合基因型和T等位基因與胃癌的發(fā)病風(fēng)險無相關(guān)性(P值大于0.05)。6.不吸煙人群RAGE基因rs2070600位點的AG基因型與胃癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān),其OR=1.71,95%CI=1.01-2.91,P=0.043.不飲酒人群RAGE基因rs2070600位點的AG基因型與胃癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān),其OR=1.75, 95%CI=1.03-2.97,P=0.037.7.rs2070600位點AG基因型血清sRAGE濃度顯著低于健康對照組和胃癌組GG基因型血清sRAGE濃度,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。rs184003位點TT基因型sRAGE水平顯著高于健康對照組和胃癌組GG基因型sRAGE水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；rs1800624位點與rs1800625位點各基因型其血清sRAGE濃度之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均大于0.05)。結(jié)論RAGE基因rs2070600位點和rs184003位點突變與廣西地區(qū)人群胃癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。rs2070600位點突變與sRAGE血清濃度負(fù)相關(guān)并增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險。rs184003突變與sRAGE血清濃度正相關(guān)并降低胃癌發(fā)病風(fēng)險
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1481093