本文關(guān)鍵詞： 茶尺蠖 信息素結(jié)合蛋白 原核表達 性信息素與茶樹揮發(fā)物質(zhì) 結(jié)合特征　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學》2017年03期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中國茶區(qū)主要的鱗翅目害蟲,其幼蟲暴食性常給茶園帶來巨大損失。鱗翅目昆蟲雌雄個體間普遍存在著性信息素通訊環(huán)節(jié),而茶尺蠖性信息素識別途徑一直鮮有報道。論文旨在通過對茶尺蠖性信息素識別過程中的結(jié)合蛋白基因進行鑒定和功能研究,為茶尺蠖性信息素化學通訊和嗅覺信息識別傳遞機制提供理論依據(jù)�！痉椒ā坷肦T-PCR技術(shù)對從雄蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中首次鑒定和發(fā)現(xiàn)的一個茶尺蠖信息素結(jié)合蛋白基因(pheromone-binding protein,PBP)2(EoblPBP2)進行全長cDNA序列克隆(Gen Bank登錄號為KX421383)后,將該基因與pET32a載體連接構(gòu)建表達載體。隨后向?qū)雙ET32a/EoblPBP2表達質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)中對其表達載體加入終濃度1 mmol·L~(-1)的IPTG進行蛋白的誘導(dǎo)表達,進一步利用鎳NTA瓊脂糖凝膠柱和含有咪唑的上清緩沖液分離目的蛋白,以PBS緩沖液作為透析液純化得到高濃度重組蛋白。最后通過熒光競爭法,利用N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作為熒光報告子以放大熒光信號,隨后向重組蛋白與1-NPN混合體系中分別加入(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯以及10種測試氣味后經(jīng)過分子熒光光度計掃描得到相對熒光值,計算各配基的解離常數(shù)KD,研究重組蛋白與茶尺蠖性信息素和茶樹揮發(fā)物的生理功能。【結(jié)果】EoblPBP2全長為492 bp,編碼了163個氨基酸,蛋白相對分子質(zhì)量為15.9kD,等電點為4.983,具有保守的6個半胱氨酸,根據(jù)分子進化樹分析其應(yīng)歸屬于昆蟲PBPs家族。結(jié)合功能結(jié)果顯示,10種測試氣味均能將1-NPN與茶尺蠖EoblPBP2重組蛋白的混合體系于420 nm處的相對熒光值降至50%以下。其中β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、苯乙醛、癸醛和反-2-癸烯醛等5種茶樹揮發(fā)物質(zhì)與EoblPBP2重組蛋白的結(jié)合能力較強,解離常數(shù)KD分別為7.923、14.830、30.368、28.068和27.597μmol·L~(-1)。而性信息素成分之一的(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯與EoblPBP2的解離常數(shù)KD僅為172.591μmol·L~(-1),僅小于苯甲醇的解離常數(shù)KD 230.880μmol·L~(-1),而遠遠大于上述5種氣味物質(zhì)。表明EoblPBP2重組蛋白具有茶尺蠖性信息素成分((Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯)和植物揮發(fā)物質(zhì)廣譜結(jié)合能力,而其與性信息素的親和力弱于大部分測試植物揮發(fā)物。【結(jié)論】EoblPBP2能與包括性信息素成分在內(nèi)的多種植物揮發(fā)物結(jié)合,可能是一種具備特殊復(fù)合功能的信息素結(jié)合蛋白,可用之進一步研究茶尺蠖的性信息素識別和傳遞途徑。
[Abstract]:[objective] Ectropis obliqua is a major Lepidoptera pest in China. The larval gluttony often brings great loss to tea garden. Sex pheromone communication is common between male and female of Lepidoptera insects. However, the way of sex pheromone recognition of tea geometrid has been rarely reported. The purpose of this paper is to identify and study the binding protein gene in the process of sex pheromone recognition of tea geometrid. To provide theoretical basis for chemical communication of sex pheromone and transduction mechanism of olfactory information in tea geometrid. [methods] A tea geometrid was first identified and discovered from the data of male antennae transcriptome by RT-PCR technique. Xanthin-binding protein gene (. Pheromone-binding protein. The full-length cDNA sequence was cloned into Gen#en1# accession number KX421383). The expression vector was constructed by ligating the gene with the pET32a vector, and then the expression vector was transformed into E. coli BL21 (DE3), which was introduced into the pET32a/EoblPBP2 expression plasmid. The expression of the protein was induced by adding 1 mmol 路L ~ (-1) IPTG into the expression vector. The target protein was separated by nickel NTA agarose gel column and the supernatant buffer containing imidazole. The high concentration recombinant protein was purified with PBS buffer as dialysis solution. Finally, the recombinant protein was purified by fluorescence competition. N-phenyl-1-naphthylamine 1-NPN (N-phenyl-1-naphthylamine) was used as a fluorescent reporter to amplify the fluorescence signal. The relative fluorescence value was obtained by molecular fluorescence photometer scanning after adding ZZG ZZZZZZZHZZZZH6O6-18 carbotriene to the mixture system of recombinant protein and 1-NPN, respectively, and 10 kinds of odors were tested by molecular fluorescence photometer. The relative fluorescence value was obtained by molecular fluorescence spectrophotometer. The dissociation constants of each ligand were calculated to study the physiological function of recombinant protein, sex pheromone of tea geometrid and tea plant volatiles. [results] the total length of EoblPBP2 was 492bp. The protein encodes 163 amino acids with a relative molecular weight of 15.9 KD and a isoelectric point of 4.983, with 6 conserved cysteines. According to molecular phylogenetic tree analysis, it belongs to the PBPs family of insects. The relative fluorescence values of 1-NPN and geometrid EoblPBP2 recombinant protein at 420nm were decreased to below 50%, among them 尾 -ionone. Dibutyl phthalate, phenylacetaldehyde, decanal and trans -2-decenal had strong binding ability with EoblPBP2 recombinant protein, and the dissociation constants were 7.923, respectively. 14.830, 30.368, 28.068 and 27.597 渭 mol 路L ~ (-1), respectively. The dissociation constant KD of 9-18 carbotriene from EoblPBP2 is only 172.591 渭 mol 路L ~ (-1). The dissociation constant KD 230.880 渭 mol 路L ~ (-1) of benzyl alcohol is only smaller than that of KD230.880 渭 mol 路L ~ (-1). The results showed that the EoblPBP2 recombinant protein had the sex pheromone component of tea geometrid, ZZG ZZN ZN3, and the above five odors were much larger than those of the above five odors. 9- 18 carbotrienes) and plant volatile substances wide spectrum binding ability. But its affinity to sex pheromone is weaker than that of most tested plant volatiles. [conclusion] EoblPBP2 can bind to many plant volatiles including sex pheromones. It may be a kind of pheromone binding protein with special complex function, which can be used to further study the sex pheromone recognition and transmission pathway of tea geometrid.
【作者單位】： 中國計量大學生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室;杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院;
【基金】：國家自然科學基金(31272053,31372254) 浙江省自然科學基金(LY13C140004) 國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-23)
【分類號】：S435.711
【正文快照】： 【研究意義】昆蟲在漫長的自然繁衍進程中,逐漸衍變出了復(fù)雜的信息感受機制來對外界環(huán)境作出響應(yīng),使其在取食、交配、產(chǎn)卵等多種行為中占據(jù)有利形勢,從而能夠生存下來并保持其自身種群的順利繁衍[1],昆蟲通過各種信息素來傳遞種間或種內(nèi)信息,因此信息素對昆蟲的集合、防御、覓

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