本文關鍵詞： 下咽癌 FaDu 放射抵抗 mRNA lncRNA 基因芯片　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景下咽癌是頭頸部惡性腫瘤中常見的一種,此類疾病患者早期癥狀不明顯,臨床就診時常累及舌根、喉腔、頸段食管等鄰近部位,并多伴有頸部淋巴結的轉移,臨床分期較晚。晚期腫瘤手術后可能影響發(fā)音、吞咽等功能,嚴重降低患者的生存治療,并有部分患者腫瘤侵犯頸部動脈者無法手術,需要行放化療。目前,下咽癌的治療是手術聯(lián)合放化療的綜合治療,多數(shù)患者術后需要接受放療,但腫瘤細胞的放射敏感性降低極大限制了放射治療的預后。腫瘤的放射敏感性或抵抗性與體內某些基因的表達調控。放射線對腫瘤細胞的殺傷作用,其原理主要是通過射線的電離輻射作用引起細胞內DNA的損傷和與細胞凋亡有關的基因和蛋白的改變,而以此啟動腫瘤細胞的凋亡過程。腫瘤細胞對放射線的敏感性差異,取決于不同的組織的細胞學類型,同一組織學類型中細胞分化程度的不同,以及同組織類型同一分化程度的細胞中某些調控基因的表達不同�；蛐酒夹g其原理是利用DNA堿基對的互補原理,提取樣品中的RNA,通過逆轉錄取得被熒光標記的cDNA,與目標芯片進行雜交后,對載體進行激光共聚焦掃描,檢測芯片上各點的熒光強度,利用軟件分析大數(shù)據(jù),推算樣品中各基因的表達水平。在眾多基因片段中分析尋找有特異表達的基因,為疾病的闡述提供部分理論依據(jù)。目的本研究通過不同劑量X線照射FaDu細胞株后,篩選出具有放射抵抗性的FaDu細胞系,分析其放射敏感程度,作為下一步實驗研究的材料。腫瘤細胞對放射線敏感性的差異與受基因表達有關,基因表達又受多種調控因子的干預。因此,對具有放射敏感差異的不同細胞進行基因表達譜分析,可以發(fā)現(xiàn)與下咽癌放射敏感性密切相關的基因,通過干預這些基因,以制定下咽癌患者的個體化治療方案。研究通過應用含人類全基因組序列的寡聚核昔酸芯片對FaDu和FaDu抵抗細胞株進行檢測,根據(jù)兩者芯片表達的差異,篩選出有差異的基因并對其進行初步驗證,以尋找與下咽癌放射敏感性相關的基因。方法應用梯度劑量射線(2Gy,4Gy,6Gy,8Gy, lOGy各2次)多次照射建立人下咽癌放射抵抗FaDu-RS細胞。通過計算克隆形成率,流式細胞儀等技術分析FaDu細胞系與FaDu-RS細胞系的差異。確定FaDu與FaDu-RS細胞系有放射敏感性差異后,應用北京博奧晶典生物技術有限公司提供的博奧晶芯LncRNA Human Gene Expression Microarray V4.0,4x180K芯片檢測FaDu細胞系與FaDu-RS細胞系接受X線照射后的基因表達譜變化,篩出兩者比較有統(tǒng)計學差異的基因。為獲得更為精準的數(shù)據(jù),我們對兩組細胞系放射性照射4Gy后0小時、2小時、48小時三個時間點的細胞分別進行芯片分析。然后使用Agilent GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理,應用KOBAS系統(tǒng)對所得差異mRNA和lncRNA進行生物學通路預測。尋找與下咽癌放射敏感性相關的主效基因,探索其放射抵抗發(fā)生的分子機制。結果1.克隆形成實驗示FaDu-RS和FaDu在放療的敏感性方面有顯著性差異,FaDu-RS的放療抵抗性明顯增強。2.芯片數(shù)據(jù)顯示在射線照射48小時后的分析中有1714條差異表達的lncRNAs(與FaDu相比,有759條lncRNAs在FaDu-RS中表達顯著增高,有955條lncRNAs在FaDu-RS中顯著降低)；此外,有2521條差異表達的mRNAs(在FaDu-RS中有1089條mRNAs表達顯著增高,有1432條mRNAs表達顯著降低)。再結合0小時、2小時的芯片分析結果,尋找在個時間點中FaDu與FaDu-RS均有差異表達的mRNA和lncRNA,我們發(fā)現(xiàn)有212條mRNA有共同顯著差異,85條lncRNA有共同顯著差異。3.應用KOBAS (KEGG Orthology Based Annotation System)預測分析,照射后48小時的差異mRNAs的生物學功能與44條細胞通路相關,G0分析發(fā)現(xiàn)247條與生物進程相關,41條與分子功能相關,15條與細胞組成相關。根據(jù)lncRNA和mRNA的共表達分析,共篩選出132條有統(tǒng)計學意義的lncRNA和mRNA共表達對。結論1. FaDu-RS細胞較FaDu細胞的放射敏感性低,FaDu-RS細胞具有放射抵抗性。2. lncRNA和mRNA在FaDu和FaDu-RS在放療反應中有差異表達,FaDu-RS細胞放射敏感性的分子機制極其復雜,是多基因、多通路協(xié)同作用的結果,涉及到細胞細胞通信、腫瘤壞死因子途徑、翻譯后蛋白修飾、小分子RNA的轉錄后沉默、P53信號通路等多種遺傳學及生物學改變。3.聚類分析得出的差異表達基因可能與FaDu細胞系放射敏感性密切相關。對有顯著差異的表達基因及調控通路的進一步研究將有助于理解下咽癌細胞放射抵抗發(fā)生的生物學機制,為腫瘤的個體化治療提供新的靶點及思路。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.63

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本文編號：1466917