本文關(guān)鍵詞： 朱砂葉螨 細胞色素P450酶系 甲氰菊酯抗性 RNA干擾 原核表達 轉(zhuǎn)錄調(diào)控　出處：《西南大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)是一種危害多種經(jīng)濟作物的重要農(nóng)業(yè)害螨。隨著化學農(nóng)藥的大量、不科學使用以及害螨自身的特點,朱砂葉螨的抗藥性問題日益加劇,對目前市場上的大部分殺螨劑都產(chǎn)生了一定程度的抗藥性,從而給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的損失。甲氰菊酯是一種常用的具有殺蟲、殺螨活性的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。研究表明朱砂葉螨、二斑葉螨以及柑橘全爪螨等都已經(jīng)對其產(chǎn)生了較高水平的抗藥性。細胞色素P450酶系是昆蟲(螨)體內(nèi)一類關(guān)鍵解毒酶系,可以代謝多種內(nèi)、外源化合物,在昆蟲(螨)對殺蟲(螨)劑的解毒代謝過程中起著十分重要的作用。目前,對于細胞色素P450介導朱砂葉螨甲氰菊酯抗性機制的報道相對較少,且多集中在生化水平層面。因此,對細胞色素P450酶系進行整體研究,并從轉(zhuǎn)錄水平上認識P450基因表達的調(diào)控機制,對于進一步明確其介導的代謝抗性機理,全面揭示朱砂葉螨代謝抗性機制具有重要意義,在實踐上對于制定朱砂葉螨抗藥性的治理策略亦具有非常重要的指導意義。本學位論文的主要研究結(jié)果總結(jié)如下:1.甲氰菊酯對朱砂葉螨敏感和甲氰菊酯抗性品系的毒力測定采用藥膜法測定出甲氰菊酯對朱砂葉螨敏感品系(SS)和甲氰菊酯抗性品系(FeR)的致死中濃度分別為606.98 mg/L和61581.93 mg/L,表明目前室內(nèi)篩選的抗性品系對甲氰菊酯的抗性已達101倍的高抗水平。經(jīng)P450酶系特異性抑制劑PBO處理后,抗性倍數(shù)下降至75倍,也就是說PBO抑制了26倍的甲氰菊酯抗性,這初步說明P450酶系在朱砂葉螨甲氰菊酯的抗性形成中具有重要作用。2.朱砂葉螨與甲氰菊酯抗性相關(guān)的P450及其功能相關(guān)基因的篩選、克隆及序列分析從本課題組之前的表達譜測序以及基因芯片數(shù)據(jù)中獲得了6條在甲氰菊酯抗性品系中過表達的P450 Unigenes片段。通過qPCR驗證表明6條P450基因在朱砂葉螨甲氰菊酯抗性品系中的表達量都顯著高于敏感品系,與表達譜測序和基因芯片數(shù)據(jù)結(jié)果一致,其上調(diào)倍數(shù)為1.96-5.92倍。對細胞色素P450還原酶基因進行qPCR分析,發(fā)現(xiàn)其在朱砂葉螨甲氰菊酯抗性品系中上調(diào)表達4.12倍。這些結(jié)果初步表明6條過表達的P450基因和1條細胞色素P450還原酶基因都與朱砂葉螨對甲氰菊酯的抗性產(chǎn)生有關(guān)�；谥焐叭~螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和二斑葉螨基因組數(shù)據(jù),通過RT-PCR技術(shù),成功克隆出朱砂葉螨6條P450基因和1條P450還原酶基因c DNA全長序列,其中6條P450基因命名以及Gene Bank登錄號分別為CYP384A1(KT851973)、CYP389B1(KF770839)、CYP391A1(KT851972)、CYP392A26(KF770838)、CYP392A28(KT851975)和CYP392D11(KT851974)。這6條P450基因的開放閱讀框長度范圍為1488 bp-1671 bp,預測蛋白分子量大小在56.79 k Da-64.03 k Da之間。將朱砂葉螨P450還原酶基因命名為TcCPR,Gen Bank登錄號為KP710970。TcCPR基因完整開放閱讀框包含2004個堿基,編碼667個氨基酸殘基,其預測蛋白分子量大小為75.47 k Da。生物信息學分析結(jié)果表明6條P450基因均為微粒體型P450,均包含一系列P450特征區(qū)域,例如螺旋C區(qū)、螺旋I區(qū)、螺旋K區(qū)、meander區(qū)域和血紅素結(jié)合區(qū)。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)CYP392A26、CYP392A28和CYP392D11屬于Clan 2,CYP384A1屬于Clan 3,而CYP389B1和CYP391A1屬于Clan 4。同樣對TcCPR生物信息學特性分析發(fā)現(xiàn)其存在跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽,氨基酸序列含有FMN、FAD及NADPH保守功能區(qū)域,與二斑葉螨Tu CPR基因的親緣關(guān)系最近,而與昆蟲綱CPR基因的親緣關(guān)系稍遠。3.朱砂葉螨P450基因和TcCPR基因的表達模式解析通過qPCR對朱砂葉螨6條P450基因在不同發(fā)育階段的m RNA水平進行檢測,結(jié)果表明不同的P450基因在不同發(fā)育階段的表達具有特異性。藥劑脅迫誘導實驗發(fā)現(xiàn)被甲氰菊酯脅迫6 h、12 h和24 h后,P450基因的表達量在敏感品系中總體變化差異不大,但是在甲氰菊酯抗性品系中都能被顯著誘導上調(diào)表達,且表達水平變化具有一定的時間效應。這些結(jié)果表明朱砂葉螨6條P450基因與甲氰菊酯抗性形成有關(guān),且在抗性品系中對甲氰菊酯的脅迫誘導更加敏感。TcCPR基因在朱砂葉螨不同發(fā)育階段的表達模式與多數(shù)朱砂葉螨P450基因具有較高的一致性,在幼螨、若螨和成螨中表達量較高,而在卵中最低,在三種螨態(tài)的表達量分別是卵期的5.40倍、4.47倍和4.75倍,反映出TcCPR與P450間的協(xié)同一致性。經(jīng)甲氰菊酯誘導6 h、12h和24 h后TcCPR基因的表達水平升高,但敏感品系中差異不大(低于1.5倍),而在甲氰菊酯抗性品系中差異顯著,其表達量分別是對照的3.70倍、3.95倍和4.61倍,再次表明P450酶系,包括TcCPR基因,在抗性品系中對甲氰菊酯的脅迫誘導反應更強烈。4.朱砂葉螨P450基因和TcCPR基因RNAi研究采用基于“葉碟飼喂法”的RNAi技術(shù)對朱砂葉螨在FeR中過表達的6條P450基因進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼喂單條P450基因ds RNA(1000 ng/μL)后,CYP384A1、CYP389B1、CYP391A1、CYP392A26、CYP392A28和CYP392D11的沉默效率達到55.27%-74.19%,朱砂葉螨P450s酶活性顯著降低1.21-2.29倍,在甲氰菊酯LC30和LC50兩個濃度下的死亡率分別增加8.39%-15.78%和7.88%-17.49%。當同時飼喂6條P450基因ds RNA混合物后,6條P450基因沉默效率為35.93%-65.64%,朱砂葉螨P450s酶活性顯著降低4.0倍,在甲氰菊酯LC30和LC50兩個濃度下的死亡率分別增加30.73%和33.17%。六條P450基因的RNAi實驗表明6條P450基因都不同程度地參與了朱砂葉螨對甲氰菊酯的抗藥性形成,且6條基因存在明顯的協(xié)同增效現(xiàn)象。同樣,對TcCPR基因?qū)嵤㏑NAi后,其在朱砂葉螨SS和FeR中的沉默效率分別達到52.5%和41.0%,FeR中的P450s酶活性顯著降低4.0倍,在甲氰菊酯LC30和LC50兩個濃度下的死亡率分別增加21.60%和26.20%,但SS對甲氰菊酯的敏感性并沒有顯著的變化。此外,抑制TcCPR基因的表達后,6條P450基因m RNA的表達水平并沒有明顯改變。這些結(jié)果表明,一方面TcCPR基因可影響P450s酶活性,另一方面朱砂葉螨FeR中P450/CPR對甲氰菊酯脅迫更敏感,在朱砂葉螨對甲氰菊酯的抗性形成中發(fā)揮了重要作用。5.朱砂葉螨P450基因和TcCPR基因原核表達研究借助大腸桿菌表達系統(tǒng)對朱砂葉螨6條P450基因和1條CPR基因進行原核表達,以期獲得體外重組蛋白并進行功能研究。最終6條P450基因和1條CPR基因都成功得到表達,但其中只有CYP384A1、CYP389B1、CYP392A28、CYP392D11和TcCPR基因獲得了可溶性重組蛋白,并且只有CYP384A1、CYP389B1和TcCPR基因的表達產(chǎn)物可檢測到蛋白活性。重組蛋白TcCPR活性為512.69±139.21 nmol/mg pro.min-1(細胞色素C為底物),CYP384A1和CYP389B1的脫甲基活性分別為3.74±0.29 nmol/mg pro.min-1和0.97±0.11 nmol/mg pro.min-1(對硝基苯甲醚為底物)。CYP384A1和CYP389B1都能夠結(jié)合并分解甲氰菊酯:甲氰菊酯對CYP384A1的抑制中濃度為181.3±18.8μM,10μg和20μg的CYP384A1對甲氰菊酯的分解率分別為30.83±3.87%和40.75±3.50%;甲氰菊酯對CYP389B1的抑制中濃度為259.3±116.1μM,10μg和20μg的CYP389B1對甲氰菊酯的分解率分別為22.57±6.88%和30.62±3.16%�；蛟吮磉_及功能驗證實驗表明,P450/CPR可直接分解甲氰菊酯,從而介導朱砂葉螨對甲氰菊酯產(chǎn)生抗藥性。6.朱砂葉螨轉(zhuǎn)錄因子對甲氰菊酯抗性相關(guān)P450基因的調(diào)控研究克隆獲得了朱砂葉螨的6條感受異源物質(zhì)脅迫的轉(zhuǎn)錄因子c DNA全長,分別命名為CncC、Maf、HNF4、HR96、USP(RXR1)和USP(RXR2)。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)CncC、Maf和HNF4在FeR中表達量都顯著高于SS,其上調(diào)倍數(shù)分別為394.83倍、3.03倍和4413.57倍,而HR96、USP(RXR1)和USP(RXR2)的m RNA表達量在SS和FeR中沒有顯著差異。通過RNAi沉默轉(zhuǎn)錄因子CncC后,CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28的m RNA表達量顯著下調(diào),P450s酶活性顯著降低,甲氰菊酯脅迫后的死亡率顯著提高了12.75%-20.40%;沉默轉(zhuǎn)錄因子Maf后,CYP389B1和CYP392A28的m RNA表達量顯著下調(diào),P450s酶活性顯著降低,甲氰菊酯脅迫后的死亡率顯著提高了19.50%-21.10%;HNF4被沉默后,P450基因表達、P450s活性以及對甲氰菊酯的敏感性都沒有顯著變化。轉(zhuǎn)錄因子RNAi研究結(jié)果表明CncC和Maf可以調(diào)控CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28的表達,從而導致朱砂葉螨對甲氰菊酯的敏感性發(fā)生改變。進一步通過熒光素酶報告系統(tǒng)對轉(zhuǎn)錄因子CncC和Maf與P450基因啟動子的結(jié)合及調(diào)控關(guān)系進行分析,發(fā)現(xiàn)CncC和Maf都能影響CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28的啟動子的熒光活性:其中CYP389B1和CYP392A28的啟動子同時結(jié)合CncC和Maf后的熒光活性要顯著大于單獨結(jié)合CncC的活性,而CYP391A1的啟動子單獨結(jié)合CncC后的熒光活性要顯著大于同時結(jié)合CncC和Maf的活性,但是三條P450基因的啟動子單獨結(jié)合Maf后的熒光活性與對照沒有顯著差異。熒光素酶結(jié)合實驗不但確證了RNAi實驗結(jié)果(即CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28確實受到CncC和Maf的調(diào)控),而且進一步明確了轉(zhuǎn)錄因子和P450基因的調(diào)控關(guān)系:CncC和CncC-Maf都能調(diào)控CYP389B1和CYP392A28的表達,CYP391A1的表達主要受CncC的調(diào)控,而Maf不能單獨調(diào)控P450基因的表達。
[Abstract]:In this paper , it is very important to study the resistance of fenpropathrin to fenpropathrin . The results are as follows : 1 . The effect of fenpropathrin on the resistance to fenpropathrin is higher than that of fenpropathrin . The results of this paper are as follows : 1 . The resistance of fenpropathrin to fenpropathrin is higher than that of fenpropathrin . The results showed that CYP392A26 , CYP392A28 and CYP392D11 contained a series of P450 characteristic regions , such as spiral C region , spiral I region , spiral K region , cytochrome region and heme binding region . The silencing efficiency of CYP392A26 , CYP392A28 and CYP392D11 was 55.27 % - 74.19 % , and the death rates of CYP392A26 , CYP392A28 and CYP392D11 were significantly decreased by 1.21 - 2.29 times . The expression of CYP389B1 , CYP391A1 and CYP392A28 was significantly lower than that of CYP389B1 , CYP391A1 and CYP392A28 . The expression of CYP389B1 , CYP391A1 and CYP392A28 was significantly lower than that of CYP389B1 , CYP391A1 and CYP392A28 .

【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S433.7

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