本文關(guān)鍵詞： 旋毛蟲 DNase Ⅱ 原核表達(dá) 多克隆抗體 酶活性 免疫定位　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：旋毛蟲是一種典型的人獸共患寄生線蟲,其逃避宿主的先天性免疫防御機(jī)制一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來公布的旋毛蟲基因組揭示了旋毛蟲擁有125個(gè)龐大的DNase Ⅱ(Deoxyribonuclease Ⅱ)家族蛋白,并且一半以上的基因被認(rèn)為編碼排泄/分泌(Excretion/Secretion,ES)產(chǎn)物。旋毛蟲具有如此龐大的DNase Ⅱ家族蛋白,但對(duì)其存在的功能和作用卻鮮有研究。目前的研究已證實(shí),不同時(shí)期的旋毛蟲ES產(chǎn)物都具有核酸酶活性,而成蟲期和新生幼蟲期的核酸酶活性明顯強(qiáng)于肌幼蟲期。本實(shí)驗(yàn)室前期利用基因探針從不同時(shí)期的旋毛蟲基因庫中獲得28條期特異性DNase Ⅱ基因,將其歸為三類,分別是新生幼蟲期(Newborn larva,NBL)T31D4、肌幼蟲期(Muscle larva,ML)P43、和成蟲期(Adult worm,Ad)T3223。本研究選擇旋毛蟲成蟲期的核酸酶基因T3223-7進(jìn)行研究,利用原核表達(dá)系統(tǒng),對(duì)旋毛蟲成蟲期的T3223-7進(jìn)行表達(dá)、鑒定,并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶活性驗(yàn)證。首先,對(duì)Gen Bank中旋毛蟲T3223-7基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)T3223-7特異性引物,然后用RT-PCR技術(shù)克隆得到T3223-7基因,構(gòu)建p ET-28a-T3223-7重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosseta(DE3)。通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白r T3223-7。重組蛋白的分子量為39.7 k Da,與理論值一致。通過His Trap純化柱和凝膠切割回收法純化重組蛋白,得到高純度蛋白。其次,利用1D酶譜驗(yàn)證T3223-7重組蛋白的核酸酶活性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇緩沖液p H5.0作為最佳反應(yīng)孵育條件。為了驗(yàn)證該蛋白酶活性是否依賴二價(jià)陽離子,反應(yīng)孵育液選用兩種情況:Ca 2+存在和EDTA存在。酶活性試驗(yàn)結(jié)果表明,在酸性條件(p H=5.0)下,T3223-7蛋白具有降解DNA的能力,并且核酸酶活性在含有Ca~（2+）或EDTA的兩種反應(yīng)溶液中都穩(wěn)定存在。結(jié)果證實(shí),旋毛蟲的DNase Ⅱ具有核酸酶活性,挑戰(zhàn)了先前的預(yù)測(cè),即認(rèn)為旋毛蟲DNase Ⅱ不具備典型的組氨酸活性位點(diǎn)而不具有酶活性。最后,我們用r T3223-7蛋白免疫家兔,獲得多克隆抗體。經(jīng)過ELISA測(cè)定抗體效價(jià)高達(dá)1:32 0000。通過Western blot分別檢測(cè)r T3223-7、天然蟲體蛋白和ES產(chǎn)物與r T3223-7抗血清的抗原識(shí)別性,結(jié)果顯示,T3223-7重組蛋白抗血清不僅能識(shí)別r T3223-7,還能特異性識(shí)別并結(jié)合天然蟲體抗原和ES產(chǎn)物中的抗原。另一方面,制備旋毛蟲成蟲切片、裸蟲和蟲體與腸道組織進(jìn)行免疫熒光定位,免疫熒光結(jié)果顯示,紅色熒光信號(hào)定位在蟲體表皮,蟲體周圍的宿主腸道組織上也有少量抗原被識(shí)別,根據(jù)這些結(jié)果推測(cè),T3223-7可能是一種由表皮細(xì)胞合成表達(dá)的核酸酶蛋白,參與宿主的免疫逃避或成蟲發(fā)育的蛻皮過程,降解體外對(duì)宿主免疫應(yīng)答起到作用或可能引起免疫反應(yīng)的DNA成分,以利于旋毛蟲在宿主體內(nèi)的寄生。
[Abstract]:Trichinella spiralis is a typical zoonotic parasitic nematode. The innate immune defense mechanism of Trichinella spiralis has been a hot topic in this field. The genome of Trichinella spiralis published in recent years revealed that Trichinella spiralis has 125 huge DNase 鈪，

本文編號(hào)：1456377