本文關(guān)鍵詞： 肉雞 急性冷/熱應(yīng)激 實(shí)時熒光定量 miRNA 雙熒光素酶　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：高密度集約化的飼養(yǎng)模式極易使肉雞產(chǎn)生熱應(yīng)激。但是,濕簾以及降溫措施不當(dāng)使用又極易產(chǎn)生冷應(yīng)激。急性冷、熱應(yīng)激的發(fā)生首先破壞的是家禽機(jī)體的免疫機(jī)能,嚴(yán)重影響肉雞的商品化生產(chǎn),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。采用現(xiàn)代生物檢測技術(shù)研究急性冷熱應(yīng)激條件下肉雞免疫細(xì)胞因子基因在各免疫器官中的表達(dá)規(guī)律,揭示micRNAs與其靶基因?qū)毙詰?yīng)激的調(diào)控機(jī)理,為培育抗寒抗熱肉雞品種提供理論依據(jù),具有重大的實(shí)際生產(chǎn)意義。本實(shí)驗(yàn)以45只28日齡體重及健康狀況相近的羅斯308肉雞為研究對象,分為正常對照組、熱應(yīng)激組和冷應(yīng)激組分別模擬實(shí)際生產(chǎn)產(chǎn)生急性熱應(yīng)激反應(yīng)和冷應(yīng)激反應(yīng)。采用實(shí)時熒光定量PCR對8個免疫細(xì)胞因子基因(IL-1、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12α、IL-12β、INF-γ)和4個熱應(yīng)激蛋白基因(Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp110)在脾臟、胸腺、法氏囊、肝臟、心臟等組織中的表達(dá)量進(jìn)行測定分析。并采用miRNA測序技術(shù)對脾臟組織的miRNAs進(jìn)行檢測,篩選差異表達(dá)miRNAs,并預(yù)測其靶基因。進(jìn)一步從細(xì)胞水平和分子水平對差異表達(dá)mi RNAs與細(xì)胞因子基因互作進(jìn)行驗(yàn)證,揭示差異miRNAs及其靶基因?qū)毙岳錈釕?yīng)激的調(diào)控機(jī)理。研究得到以下結(jié)果:1.在脾臟組織中,只有急性熱應(yīng)激條件下IL-1α和IL-1兩個基因表達(dá)影響顯著升高(P0.05);在胸腺組織中,除IL-12α表達(dá)在各處理組無顯著變化,其余7個細(xì)胞因子表達(dá)量均顯著下降;在法氏囊組織中,各處理組均未檢測到IL-12α的表達(dá),急性熱應(yīng)激條件下其他7個細(xì)胞因子基因表達(dá)均顯著下降(P0.05)。2.在心臟組織與肝臟組織中,急性熱應(yīng)激條件下HSP70與HSP110表達(dá)極顯著升高(P0.01)。3.對脾臟組織mi RNA測序結(jié)果揭示,根據(jù)|log2Fold|1和p value0.05原則,正常組和熱應(yīng)激組之間篩選出12個差異表達(dá)miRNAs,在正常組和冷應(yīng)激組之間發(fā)現(xiàn)1個差異表達(dá)miRNAs,在冷應(yīng)激和熱應(yīng)激組之間篩選出20個差異表達(dá)miRNAs。通過對所有差異表達(dá)miRNAs把基因的預(yù)測,篩選出4個差異表達(dá)mi RNAs的靶基因?yàn)槊庖呒?xì)胞因子基因。4.通過WEGO和GO Pathway通路富集分析,急性熱應(yīng)激條件下差異表達(dá)miRNAs顯著富集在細(xì)胞因子互作的通路中。5.雙熒光素酶報告結(jié)果表明,gga-miR-34a-5P和gga-miR-449c-5P對IL-2和IL-12α的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控的作用。綜上所述,本研究結(jié)果表明,急性熱應(yīng)激對免疫細(xì)胞因子的表達(dá)影響較大,尤其對胸腺組織中免疫細(xì)胞因子基因表達(dá)影響最大,而冷應(yīng)激影響較小;各免疫細(xì)胞因子在不同組織中表達(dá)規(guī)律不一致;急性應(yīng)激條件下,熱應(yīng)激蛋白Hsp70和Hsp110的表達(dá)極顯著上調(diào)(P0.01)。gga-mi R-34a-5p和gga-miR-449c-5p對細(xì)胞因子基因IL-2與IL-12有極顯著下調(diào)作用(P0.01),抑制了IL-2與IL-12表達(dá)水平。
[Abstract]:The high density intensive feeding mode can easily cause heat stress in broilers. However, cold stress is easy to be produced when wet curtains and cooling measures are not used properly. The occurrence of heat stress is the first damage to the immune function of poultry, seriously affecting the commercial production of broilers. Modern biological detection technique was used to study the expression of immune cytokine gene in immune organs of broilers under acute cold and heat stress. To reveal the regulation mechanism of micRNAs and its target gene on acute stress and to provide theoretical basis for breeding cold-resistant and heat-resistant broiler breeds. In this study, 45 rose-308 broilers with similar body weight and health status were divided into normal control group. The heat stress group and the cold stress group simulated the actual production to produce acute heat stress response and cold stress response respectively. IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 偽, IL-12 尾, INF- 緯) and four heat stress protein genes, Hsp60, Hsp70. Hsp90 and Hsp110) in spleen, thymus, bursa of Fabricius, liver. The expression of miRNAs in spleen tissue was detected by miRNA sequencing, and the differential expression of miRNAs was screened. The target genes were predicted and the interaction between the differentially expressed mi RNAs and cytokine genes was further verified at the cellular and molecular levels. To reveal the regulation mechanism of differential miRNAs and its target gene on acute cold and heat stress. The following results were obtained: 1. In spleen tissue. Under acute heat stress, the expression of IL-1 偽 and IL-1 genes increased significantly (P 0.05). In thymus tissues, the expression of IL-12 偽 did not change significantly in all treatment groups, but the expression of other seven cytokines decreased significantly. No expression of IL-12 偽 was detected in the tissues of bursa of Fabricius. The expression of other seven cytokines genes decreased significantly under acute heat stress in heart and liver tissues. The expression of HSP70 and HSP110 was significantly increased under acute heat stress. The results of mi RNA sequencing in spleen tissue revealed that the expression of Mi RNA was significantly higher than that of control group (P 0.01). According to the principle of log2Fold 1 and p value0.05, 12 differentially expressed miRNAs were screened between normal group and heat stress group. There was a difference in expression of miRNAs between normal group and cold stress group. Twenty differentially expressed miRNAs were screened between cold stress and heat stress groups. All differentially expressed miRNAs genes were predicted. Four differentially expressed targets of mi RNAs were screened because of the immunocyte factor gene. 4. Enrichment analysis of WEGO and go Pathway pathway was carried out. The differential expression of miRNAs was significantly enriched in the cytokine interaction pathway under acute heat stress. Gga-miR-34a-5P and gga-miR-449c-5P play a negative role in the expression of IL-2 and IL-12 偽. Acute heat stress had a great effect on the expression of immune cytokines, especially on the gene expression of immune cytokines in thymus tissues, but cold stress had little effect on the expression of immune cytokines. The expression of immune cytokines in different tissues was not consistent. Under acute stress. The expression of heat stress protein (Hsp70) and heat stress protein (Hsp110) were significantly up-regulated (P0.01). GGa-mi R-34a-5p and gga-miR-449c-5p significantly down-regulated cytokine gene IL-2 and IL-12 (P0.01). The expression of IL-2 and IL-12 was inhibited.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S858.31

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本文編號：1455844