本文關鍵詞： 肉雞 急性冷/熱應激 實時熒光定量 miRNA 雙熒光素酶　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：高密度集約化的飼養(yǎng)模式極易使肉雞產(chǎn)生熱應激。但是,濕簾以及降溫措施不當使用又極易產(chǎn)生冷應激。急性冷、熱應激的發(fā)生首先破壞的是家禽機體的免疫機能,嚴重影響肉雞的商品化生產(chǎn),造成巨大的經(jīng)濟損失。采用現(xiàn)代生物檢測技術研究急性冷熱應激條件下肉雞免疫細胞因子基因在各免疫器官中的表達規(guī)律,揭示micRNAs與其靶基因對急性應激的調控機理,為培育抗寒抗熱肉雞品種提供理論依據(jù),具有重大的實際生產(chǎn)意義。本實驗以45只28日齡體重及健康狀況相近的羅斯308肉雞為研究對象,分為正常對照組、熱應激組和冷應激組分別模擬實際生產(chǎn)產(chǎn)生急性熱應激反應和冷應激反應。采用實時熒光定量PCR對8個免疫細胞因子基因(IL-1、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12α、IL-12β、INF-γ)和4個熱應激蛋白基因(Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp110)在脾臟、胸腺、法氏囊、肝臟、心臟等組織中的表達量進行測定分析。并采用miRNA測序技術對脾臟組織的miRNAs進行檢測,篩選差異表達miRNAs,并預測其靶基因。進一步從細胞水平和分子水平對差異表達mi RNAs與細胞因子基因互作進行驗證,揭示差異miRNAs及其靶基因對急性冷熱應激的調控機理。研究得到以下結果:1.在脾臟組織中,只有急性熱應激條件下IL-1α和IL-1兩個基因表達影響顯著升高(P0.05);在胸腺組織中,除IL-12α表達在各處理組無顯著變化,其余7個細胞因子表達量均顯著下降;在法氏囊組織中,各處理組均未檢測到IL-12α的表達,急性熱應激條件下其他7個細胞因子基因表達均顯著下降(P0.05)。2.在心臟組織與肝臟組織中,急性熱應激條件下HSP70與HSP110表達極顯著升高(P0.01)。3.對脾臟組織mi RNA測序結果揭示,根據(jù)|log2Fold|1和p value0.05原則,正常組和熱應激組之間篩選出12個差異表達miRNAs,在正常組和冷應激組之間發(fā)現(xiàn)1個差異表達miRNAs,在冷應激和熱應激組之間篩選出20個差異表達miRNAs。通過對所有差異表達miRNAs把基因的預測,篩選出4個差異表達mi RNAs的靶基因為免疫細胞因子基因。4.通過WEGO和GO Pathway通路富集分析,急性熱應激條件下差異表達miRNAs顯著富集在細胞因子互作的通路中。5.雙熒光素酶報告結果表明,gga-miR-34a-5P和gga-miR-449c-5P對IL-2和IL-12α的表達具有負調控的作用。綜上所述,本研究結果表明,急性熱應激對免疫細胞因子的表達影響較大,尤其對胸腺組織中免疫細胞因子基因表達影響最大,而冷應激影響較小;各免疫細胞因子在不同組織中表達規(guī)律不一致;急性應激條件下,熱應激蛋白Hsp70和Hsp110的表達極顯著上調(P0.01)。gga-mi R-34a-5p和gga-miR-449c-5p對細胞因子基因IL-2與IL-12有極顯著下調作用(P0.01),抑制了IL-2與IL-12表達水平。
[Abstract]:The high density intensive feeding mode can easily cause heat stress in broilers. However, cold stress is easy to be produced when wet curtains and cooling measures are not used properly. The occurrence of heat stress is the first damage to the immune function of poultry, seriously affecting the commercial production of broilers. Modern biological detection technique was used to study the expression of immune cytokine gene in immune organs of broilers under acute cold and heat stress. To reveal the regulation mechanism of micRNAs and its target gene on acute stress and to provide theoretical basis for breeding cold-resistant and heat-resistant broiler breeds. In this study, 45 rose-308 broilers with similar body weight and health status were divided into normal control group. The heat stress group and the cold stress group simulated the actual production to produce acute heat stress response and cold stress response respectively. IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 偽, IL-12 尾, INF- 緯) and four heat stress protein genes, Hsp60, Hsp70. Hsp90 and Hsp110) in spleen, thymus, bursa of Fabricius, liver. The expression of miRNAs in spleen tissue was detected by miRNA sequencing, and the differential expression of miRNAs was screened. The target genes were predicted and the interaction between the differentially expressed mi RNAs and cytokine genes was further verified at the cellular and molecular levels. To reveal the regulation mechanism of differential miRNAs and its target gene on acute cold and heat stress. The following results were obtained: 1. In spleen tissue. Under acute heat stress, the expression of IL-1 偽 and IL-1 genes increased significantly (P 0.05). In thymus tissues, the expression of IL-12 偽 did not change significantly in all treatment groups, but the expression of other seven cytokines decreased significantly. No expression of IL-12 偽 was detected in the tissues of bursa of Fabricius. The expression of other seven cytokines genes decreased significantly under acute heat stress in heart and liver tissues. The expression of HSP70 and HSP110 was significantly increased under acute heat stress. The results of mi RNA sequencing in spleen tissue revealed that the expression of Mi RNA was significantly higher than that of control group (P 0.01). According to the principle of log2Fold 1 and p value0.05, 12 differentially expressed miRNAs were screened between normal group and heat stress group. There was a difference in expression of miRNAs between normal group and cold stress group. Twenty differentially expressed miRNAs were screened between cold stress and heat stress groups. All differentially expressed miRNAs genes were predicted. Four differentially expressed targets of mi RNAs were screened because of the immunocyte factor gene. 4. Enrichment analysis of WEGO and go Pathway pathway was carried out. The differential expression of miRNAs was significantly enriched in the cytokine interaction pathway under acute heat stress. Gga-miR-34a-5P and gga-miR-449c-5P play a negative role in the expression of IL-2 and IL-12 偽. Acute heat stress had a great effect on the expression of immune cytokines, especially on the gene expression of immune cytokines in thymus tissues, but cold stress had little effect on the expression of immune cytokines. The expression of immune cytokines in different tissues was not consistent. Under acute stress. The expression of heat stress protein (Hsp70) and heat stress protein (Hsp110) were significantly up-regulated (P0.01). GGa-mi R-34a-5p and gga-miR-449c-5p significantly down-regulated cytokine gene IL-2 and IL-12 (P0.01). The expression of IL-2 and IL-12 was inhibited.
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S858.31

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