本文關鍵詞： 家蠶 載脂蛋白D 表達特征 氧化應激 細菌侵染　出處：《西南大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：載脂蛋白D作為一種糖蛋白,主要存在于血液中的高密度脂蛋白(HDL),同時廣泛分布于各組織中。載脂蛋白D主要作為脂類,固醇類物質的轉運體,同時還參與中樞神經系統(tǒng)和周圍神經系統(tǒng)的修復,免疫系統(tǒng)反應,抵抗外界壓力信號,改變運動能力以及參與一些神經退行性疾病。載脂蛋白D廣泛存在于不同物種中,通過由八個反向平行的β折疊形成的L-型桶狀結構與一些疏水性的小分子結合,運輸到靶組織,參與調控組織的發(fā)育等生理功能。載脂蛋白D在人類,小鼠,以及果蠅中有著深入的研究,然而在家蠶中研究卻鮮有報道。作為一種重要的鱗翅目經濟性昆蟲的家蠶,一直以來受到廣泛的關注。同時家蠶在發(fā)育過程中伴隨著巨大形態(tài)學和功能學的變化。利用蛋白質組學技術,我們從家蠶蛹后期鑒定出了兩個具有l(wèi)ipocalin結構域的載脂蛋白D(Apolipoprotein D)基因,在SilkDB編號為BGIBMGA002703,BGIBMGA002704。本研究主要通過生物信息學分析、基因克隆、原核表達、Western Blot技術、免疫組化、熒光定量PCR等方法鑒定到家蠶的兩個載脂蛋白D蛋白,編號為BGIBMGA002703,BGIBMGA002704基因(ApoDⅠ和ApoDⅡ),并對其進行了克隆表達及抗體的制備研究,對其組織和時期表達特征進行探究及組織定位分析,同時對其功能進行了初步探究。主要研究結果如下:1、家蠶載脂蛋白D(ApoDⅠ、ApoDⅡ)的鑒定及生物信息學分析;通過對家蠶蛹后期的蛻皮液和血液的雙向電泳分析,鑒定到了在SilkDB上編號為BGIBMGA002703,BGIBMGA002704的兩個基因,基因定位于家蠶大造種的第五號染色體上,具體位置分別為nscaf2529:4191766..4194594(+strand)和nscaf2529:4202485..4205359(+strand)。芯片數據和RT-PCR顯示,ApoDⅠ主要在家蠶的頭部和精巢表達,ApoDⅡ主要在家蠶的頭部和中部及后部絲腺表達�；蚪M結構顯示它們都具有4個外顯子和3個內含子,結構域預測結果顯示apodⅠ具有一個lipocalin(pf00061)結構域,apodⅡ具有一個lipocalin_2(pf08212)結構域。兩者氨基酸序列比對具有24.65%的相似性。對apodⅠ和apodⅡ基因進行序列分析發(fā)現,它們都具有信號肽序列。同時對兩個基因的編碼的蛋白的三級結構預測顯示,都能形成一個由八個反向平行的β折疊形成的l-型桶狀結構。進化關系顯示家蠶的apodⅠ基因與美國白蛾的載脂蛋白d基因進化關系較近,apodⅡ基因與內華達白蟻載脂蛋白d基因的進化關系較近。利用silkdb進行多序列比對,鑒定出家蠶中9個lipocalin家族基因,共聚為三類,第一類主要在中腸特異表達,第二類主要在絲腺表達,第三類廣泛的在生殖腺,馬氏管,脂肪體,頭和血淋巴中表達。2、家蠶載脂蛋白d基因的原核表達、純化和抗體制備;通過對apodⅠ和apodⅡ基因的序列分析,設計不包含信號肽序列的表達引物。以蛹兩天的cdna為模板進行pcr擴增,將獲得的片段插入到p28(pet-28a改造)載體上,測序成功后轉化到transetta(de3)表達菌株內,發(fā)現apodⅠ和apodⅡ都以包涵體的形式表達。純化apodⅡ的包涵體,制備抗體。為獲得可溶性的蛋白,又構建了pet-sumo-apodⅠ和pet-sumo-apodⅡ兩個原核表達載體,測序正確后,轉化入transetta(de3)表達菌株內,在上清中獲得了sumo-apodⅠ和sumo-apodⅡ兩個重組蛋白。3、家蠶載脂蛋白d的組織及時空表達分析及免疫組化;利用rt-pcr對五齡第3天家蠶各組織檢測,發(fā)現apodⅠ基因主要在頭部和精巢表達,apodⅡ基因主要在家蠶頭部和絲腺表達。利用rt-pcr和q-pcr對五齡到蛹發(fā)育時期整蠶的核酸水平檢測,發(fā)現apodⅠ基因主要在蛹期表達,其中在化蛹第3天表達量達到最高。apodⅡ基因在蛹前期及蛹后期、蛾期有高量表達。利用westernblot技術對apodⅡ蛋白水平的表達檢測發(fā)現,apodⅡ蛋白主要存在家蠶五齡3天的頭部,脂肪體,生殖腺,以及中部和后部絲腺中。對家蠶五齡到蛹期的時期血液檢測發(fā)現,apodⅡ主要存在于上簇及蛹后期的血液中。對蛹期的頭和卵巢的檢測發(fā)現,在頭中apodⅡ主要在蛹6天高量表達,卵巢中apodⅡ主要在蛹后期及蛾期有高表達。利用免疫熒光技術對載脂蛋白d(apodⅡ)進行組織定位,發(fā)現apodⅡ在家蠶五齡3天的精巢,卵巢,上簇時期的腦,化蛾當天的復眼中檢測到了信號。4、家蠶載脂蛋白d基因對壓力應激和細菌侵染的響應及調控初探選取uv和h2o2作為外界壓力信號,大腸桿菌和沙雷氏菌作為細菌侵染的菌株,處理家蠶,通過q-pcr檢測發(fā)現,apodⅠ和apodⅡ基因通過上調表達來響應外界壓力信號,同時在細菌侵染實驗中,ApoDⅠ和ApoDⅡ基因也以上調的方式來響應外界細菌侵染。為進一步解釋可能調控方式,我們選取ApoDⅡ基因的5`上游1500bp的啟動子序列,通過分析和結合文獻,我們發(fā)現了與壓力信號相關的參與DNA損傷修復的轉錄因子結合位點以及參與免疫活動相關的轉錄因子結合位點。通過在ApoDⅡ基因啟動子區(qū)域發(fā)現大量BRC結合位點,通過蛻皮激素處理BmE細胞6小時后檢測發(fā)現,ApoDⅡ基因的表達量顯著上調,推測ApoDⅡ基因可能與蛻皮激素調控相關。
[Abstract]:Apolipoprotein D is a glycoprotein, high density lipoprotein is mainly found in the blood (HDL), and is widely distributed in various tissues. Apolipoprotein D mainly as lipids, steroid material transporter, also involved in the repair of central nervous system and peripheral nervous system, immune system response, resistance to outside the pressure signal, change the movement ability and participate in some neurodegenerative diseases. Apolipoprotein D widely exists in different species, through the combination of small molecule L- type barrel structure formed of eight antiparallel beta sheet and some hydrophobic, transported to the target tissue, the development of physiological functions involved in the regulation of tissue. Apolipoprotein D in humans, mice and Drosophila have in-depth study, but there were few studies in the silkworm Bombyx mori. As an important economic insect of Lepidoptera, has received extensive attention. At the same time in the process of the development of silkworm with great morphology and function. By using proteomics technology, we have produced two lipocalin domains of apolipoprotein D from Silkworm (Apolipoprotein D) later identified in the SilkDB gene, named BGIBMGA002703, BGIBMGA002704., this research mainly through bioinformatics analysis, gene cloning and prokaryotic expression of Western, Blot, immunohistochemistry, fluorescence quantitative PCR methods to identify two apolipoprotein D protein of Bombyx mori, numbered BGIBMGA002703, BGIBMGA002704 gene (ApoD I and ApoD II), and has carried on the study on the preparation of cloning and expression of antibodies, expression characteristics and exploration the organization location analysis on its structure and period, and the function has carried on the preliminary exploration. The main results are as follows: 1, silkworm apolipoprotein D (ApoD I and ApoD II) identification and analysis of biological information; Through two-dimensional electrophoresis of the late silkworm molting fluid and blood analysis were identified in the SilkDB number BGIBMGA002703, two of BGIBMGA002704 gene, gene mapping in the silkworm created a specific location on chromosome fifth, respectively nscaf2529:4191766..4194594 (+strand) and nscaf2529:4202485..4205359 (+strand). The chip data and RT-PCR display ApoD I mainly expressed in silkworm head and testis, mainly in the silkworm ApoD II and the head of the middle and posterior silk gland. The expression of the genome structure show they have 4 exons and 3 introns, domain prediction results show that the APOD I have a lipocalin (pf00061) domain, APOD II has a lipocalin_2 (pf08212) domain. The two amino acid sequence has 24.65% similarity. Sequence analysis showed the APOD I and APOD II gene, it has signal peptide sequence As predicted at the same time. The three stage structure of two genes encoding proteins that can form a consists of eight antiparallel beta folding type l- barrel structure. The evolutionary relationship shows close evolutionary relationship of the apolipoprotein D gene APOD gene of silkworm and American white moth, more recent evolution the relationship between APOD gene and apolipoprotein D gene in Nevada termites. Multiple sequence alignment was performed using silkdb, a identification 9 lipocalin family genes in the silkworm, copolymerization into three categories, the first category is mainly in the midgut specific expression, second class is mainly expressed in silk gland, third kinds of widely in gonad, Malpighian tubules, fat body, head and blood with Bazhong.2 expression, prokaryotic expression of silkworm apolipoprotein D gene, purification and antibody preparation; the sequence of APOD I and APOD II gene expression analysis, primer design does not contain a signal peptide sequence. With the pupa two days of cDNA as the template for PC R was inserted into the fragment to p28 vector (pET-28a transformation), sequencing was transformed into transetta (DE3) expression strain, APOD I and APOD II are expressed in the form of inclusion bodies. The purification of inclusion body of APOD, the preparation of antibody. In order to obtain soluble protein, and construct the pet-sumo-apod I and pet-sumo-apod II two prokaryotic expression vector after sequencing and transformed into transetta (DE3) expression strain, obtained the sumo-apod I and sumo-apod II two.3 recombinant protein in the supernatant, and the spatial and temporal expression analysis and immunohistochemistry of silkworm apolipoprotein D; detection of five at the age of third days the silkworm tissues by RT-PCR, found APOD gene mainly expressed in head and testis, APOD II gene mainly expressed in silkworm silk gland and head. Detected by RT-PCR and Q-PCR to the five instar developmental period of pupae on the nucleic acid levels of whole silkworm, APOD I gene The expression in the pupal stage, of which the highest expression of.Apod II gene in pupa and pupa stage in the late pupation for third days, the moth has high quantity expression. Found on the expression of APOD II protein level detected by Westernblot technology, APOD II protein mainly exists five silkworm 3 days old head, fat body and gonads, and the middle and posterior silk gland of Bombyx mori. Five instar to the pupal period blood test found that APOD II mainly exists in the cluster and later on pupal blood. Detection of the pupal stage head and ovary, head in APOD II is mainly expressed in pupae 6 days, mainly in the ovary of APOD II late pupa and moth stages had high expression by immunofluorescence on apolipoprotein D (APOD II) were found in the tissue localization, APOD II five 3 day old silkworm testis, ovary, brain on the cluster period, the eye of the moth was detected in the.4 signal, silkworm apolipoprotein D gene on pressure Study on regulation of stress and stress response and bacterial infection using UV and H2O2 as the external pressure signal, Escherichia coli and Serratia strains as bacterial infection, treatment of silkworm, detected by Q-PCR, APOD I and APOD II gene in response to external pressure signal through upregulation of expression, at the same time in the bacterial infection in the experiment, ApoD I and the ApoD II gene also above a way to respond to external bacterial infection. In order to further explain the possible regulation, we selected 5` 1500bp upstream of the promoter sequence of ApoD gene, through analysis and combined with the literature, we found that the transcription factor involved in DNA damage repair related pressure signal binding sites and transcription factors involved in immune the activities related to the binding sites in the promoter regions. Through the ApoD II gene found a large number of BRC binding sites by ecdysone treatment of BmE cells after 6 hours of detection, ApoD The expression of gene was upregulated and presumably ApoD gene with ecdysone.

【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 劉歡;李向平;;載脂蛋白A5與血脂代謝[J];心血管病學進展;2006年S1期

2 龍驍;李向平;;載脂蛋白A5研究現狀[J];中國動脈硬化雜志;2006年09期

3 王磊;宿紅艷;明永飛;趙志文;;載脂蛋白D的結構、功能及臨床應用[J];細胞生物學雜志;2008年01期

4 劉秉文;;載脂蛋白AI及B測定標準化問題第一次調查報告[J];生命的化學(中國生物化學會通訊);1991年05期

5 王鐵城,陳保生;牛血清載脂蛋白A-I的研究[J];動物學雜志;1992年05期

6 許霖水;載脂蛋白B的分子生物學基礎[J];生物化學與生物物理進展;1992年01期

7 孫淑斌，盧元芳，李修善;載脂蛋白AⅠ的分離純化方法[J];曲阜師范大學學報(自然科學版);1995年02期

8 陳培利;載脂蛋白E基因調控的研究進展[J];中國動脈硬化雜志;1997年03期

9 梁利波,黎健;載脂蛋白AI的抗動脈粥樣硬化作用[J];中國動脈硬化雜志;1998年04期

10 高純,周新;載脂蛋白CⅡ研究進展[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;2000年06期

相關會議論文 前10條

1 翟成凱;雷林東;原傳志;;肺心病急性發(fā)作期載脂蛋白含量變化及其臨床意義[A];中華醫(yī)學會全國第五次急診醫(yī)學學術會議論文集[C];1994年

2 范樂明;;載脂蛋白A5基因變異與動脈粥樣硬化性心血管疾病[A];第八次全國動脈硬化性疾病學術會議論文集[C];2005年

3 董廣濤;王秀潔;王明軒;郭利莉;;全身炎癥反應綜合征載脂蛋白A-Ⅰ的變化及臨床意義[A];第十一次全國急診醫(yī)學學術會議暨中華醫(yī)學會急診醫(yī)學分會成立二十周年慶典論文匯編[C];2006年

4 夏駿;劉芳;周新;;載脂蛋白M的研究進展[A];2007年浙江省醫(yī)學檢驗學學術年會論文匯編[C];2007年

5 蘇曼曼;許天敏;王毅;宿曉云;顏煒群;;重組人載脂蛋白E3在畢赤酵母中的表達與鑒定[A];吉林省第六屆生命科學大型學術報告會論文集[C];2008年

6 周藝峰;;載脂蛋白檢測與意義[A];第十屆全軍檢驗醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2005年

7 劉瑞定;陳春曉;;載脂蛋白A1、B檢測在肝硬化并發(fā)肝性腦病預后判斷中的意義[A];2006年浙江省感染病、肝病學術會議論文匯編[C];2006年

8 胡鵬;經承學;覃遠漢;陳萍;李銘芳;;人類載脂蛋白B編輯催化多肽-1的生物信息學分析[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術會議論文匯編[C];2006年

9 王磊;宿紅艷;王昌留;趙志文;;載脂蛋白D結構、功能及臨床應用的研究進展[A];遺傳學進步與人口健康高峰論壇論文集[C];2007年

10 張聰聰;田勇;盧立志;石放雄;;載脂蛋白A5降低甘油三酯效應的機理[A];全國動物生理生化第十次學術交流會論文摘要匯編[C];2008年

相關重要報紙文章 前7條

1 張超群；范曉莉;高水平載脂蛋白E4基因可保護肝臟[N];中國醫(yī)藥報;2005年

2 張文;散步減肥[N];云南政協報;2000年

3 高坤;教你看懂血脂化驗報告[N];保健時報;2004年

4 中南大學湘雅二醫(yī)院 楊燕貽;血脂檢查前應注意什么[N];家庭醫(yī)生報;2005年

5 中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所研究員 郭伽;查血預知心臟病發(fā)病風險[N];健康報;2010年

6 解放軍第260醫(yī)院 牛海玲;血脂高低與疾病[N];河北科技報;2009年

7 艾舒華;查血脂前須注意什么[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2007年

相關博士學位論文 前10條

1 古今剛;乙型肝炎病毒對血漿載脂蛋白表達影響的研究及其機制探討[D];武漢大學;2013年

2 朱雙利;下肢深靜脈血栓的超聲診斷價值及相關診斷方法的應用研究[D];重慶醫(yī)科大學;2016年

3 賀延春;北京鴨血清主要載脂蛋白的結構和某些功能研究[D];中國協和醫(yī)科大學;1990年

4 楊柳;載脂蛋白M與肥胖代謝異常及其干預探討[D];中南大學;2010年

5 朱大明;低密度脂蛋白膽固醇代謝主要相關基因低密度脂蛋白受體和載脂蛋白B的點突變研究[D];中國協和醫(yī)科大學;1998年

6 蔣波;葡糖胺對載脂蛋白M代謝的影響和機制研究[D];蘇州大學;2011年

7 尹銀亮;北京鴨載脂蛋白apoA-I結構與功能的研究[D];中國協和醫(yī)科大學;1995年

8 胡鵬;載脂蛋白基因多態(tài)性與原發(fā)性腎病綜合征血脂代謝紊亂的關系[D];廣西醫(yī)科大學;2008年

9 胡松;人類載脂蛋白AⅤ與血脂和炎癥因子的關系以及TNF-α下調其表達的機制初探[D];中南大學;2008年

10 俞娟;載脂蛋白C3在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的作用[D];第二軍醫(yī)大學;2012年

相關碩士學位論文 前10條

1 王燕慶;冠心病患者血清同型半胱氨酸與載脂蛋白a-Ⅰ、尿酸、總膽紅素、胱抑素C的相關性研究[D];山西醫(yī)科大學;2016年

2 顏麗;載脂蛋白對家族性高膽固醇血癥的鑒別診斷及與家系成員冠心病的關系的研究[D];蘭州大學;2016年

3 張景展;載脂蛋白C-Ⅲ基因多態(tài)性與冠心病關系的Meta分析[D];新疆醫(yī)科大學;2016年

4 陳世達;家蠶Apolipoprotein D基因克隆及功能分析[D];西南大學;2016年

5 劉洪堯;載脂蛋白M對小鼠血清白細胞介素-10和白細胞介素-6的影響[D];蘇州大學;2016年

6 李亞東;分泌型載脂蛋白E與丙型肝炎病毒顆粒的細胞外相互作用[D];北京協和醫(yī)學院;2016年

7 樊明智;載脂蛋白E基因多態(tài)性與血脂代謝及心血管疾病研究進展[D];重慶醫(yī)科大學;2016年

8 陳書琴;蒼附導痰湯加減方對IR型PCOS及載脂蛋白B/載脂蛋白A1代謝的臨床研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2016年

9 趙瑞芬;載脂蛋白C3基因多態(tài)性與妊娠期高血壓疾病的關系的研究[D];吉林大學;2006年

10 劉楊;ATP結合盒轉運子Al對肝X受體與載脂蛋白M調節(jié)通路的影響[D];蘇州大學;2011年

，

本文編號：1451933