本文關(guān)鍵詞： 急性淋巴細胞白血病 PTPN21 增殖 耐藥 MAPK通路 CRISPR-Cas9　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:急性淋巴細胞白血病(AcuteLymphoblastic Leukemia,ALL),是一種以骨髓、外周血和其他器官中未成熟淋巴細胞的異常增殖為特點的惡性克隆性疾病,成人ALL具有長期預(yù)后差、復(fù)發(fā)后生存率低的特點。在ALL的發(fā)病機制中,遺傳學(xué)改變發(fā)揮了關(guān)鍵作用,探索ALL的遺傳學(xué)特點不僅有助于明確發(fā)病機制,更有助于指導(dǎo)臨床治療。既往研究報道PTKs和PTPs的基因突變或表達量異常導(dǎo)致信號通路分子異常的磷酸化或去磷酸化過程,導(dǎo)致細胞的增殖增加、分化異�；虻蛲龈淖儚亩贏LL的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PTPN21基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型21,以往報道其在腫瘤組織中高表達并參與腫瘤細胞的生長,但PTPN21基因是否在ALL中異常高表達尚不明確,PTPN21基因在ALL中發(fā)揮何種作用尚有待研究。本研究通過檢測ALL患者骨髓標本發(fā)現(xiàn)PTPN21基因的異常高表達,進一步通過慢病毒感染在ALL的細胞株中過表達PTPN21基因或利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除PTPN21基因,檢測PTPN21表達量的改變對細胞的凋亡、增殖周期以及耐藥的影響,并探索相關(guān)機制。第一章PTPN21基因的過表達在急性淋巴細胞白血病的增殖周期和耐藥中的作用及機制研究目的:研究PTPN21基因在急性淋巴細胞白血病中的作用,探索PTPN21是否參與細胞的增殖周期的調(diào)控和耐藥的發(fā)生,闡明相關(guān)機制。方法:通過熒光定量PCR檢測ALL患者和對照組骨髓標本中的PTPN21基因的mRNA水平;慢病毒感染的方法在ALL細胞株:Jurkat、NALM-6和Reh細胞中過表達PTPN21基因;Western blotting和免疫熒光鑒定PTPN21蛋白的過表達和檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率;流式細胞術(shù)檢測ALL細胞過表達組和對照組的凋亡和增殖周期;Western blotting檢測Src和MAPK通路的磷酸化水平;MAPK通路小分子抑制劑實驗驗證相關(guān)通路的作用;柔紅霉素處理過表達組和對照組細胞并通過流式細胞術(shù)檢測凋亡來研究ALL細胞的耐藥;數(shù)字基因表達譜測序篩選差異表達基因,熒光定量PCR驗證,探索耐藥相關(guān)機制。結(jié)果:ALL患者中PTPN21基因的mRNA水平異常增高,并且初診和復(fù)發(fā)的患者中PTPN21基因顯著高表達,而完全緩解的患者PTPN21基因的mRNA水平與對照組無顯著性差異;在Jurkat、NALM-6和Reh細胞中,過表達PTPN21基因不影響細胞的凋亡,過表達組的GO期細胞比例均顯著性低于對照組,而S/G2/M期細胞比例則顯著性高于對照組,兩組的G1期細胞比例無顯著性差異,表明PTPN21基因的過表達促進了Jurkat、NALM-6和Reh細胞的增殖;Jurkat細胞中過表達組的Src的磷酸化水平明顯減弱,ERK1/2和JNK的磷酸化水平明顯增強,p38的磷酸化水平無明顯變化;NALM-6細胞過表達組的Src的磷酸化水平明顯減弱,ERK1/2和p38的磷酸化水平明顯增強,JNK的磷酸化水平無顯著性變化;Reh細胞過表達組的Src的磷酸化水平明顯減弱,ERK1/2、p38和JNK的磷酸化水平均明顯增強;ERK1/2通路抑制劑PD98059并不影響PTPN21的促進ALL細胞增殖的作用;JNK通路抑制劑SP600125能有效逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進Jurkat細胞增殖的作用,但不能逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進Reh細胞增殖的作用;p38通路抑制劑SB203580能有效逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進NALM-6細胞增殖的作用,并且能部分逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進Reh細胞增殖的作用;PTPN21基因抑制了Jurkat和NALM-6細胞對柔紅霉素的敏感性;數(shù)字基因表達譜測序初步篩選,熒光定量PCR驗證發(fā)現(xiàn)IL22RA1基因的mRNA水平上調(diào)。結(jié)論:PTPN21基因的異常高表達可能參與了ALL的發(fā)病和復(fù)發(fā);PTPN21可能通過去磷酸化Src激活其激酶活性,進一步激活下游MAPK通路,從而促進了 ALL細胞的增殖;參與PTPN21調(diào)控細胞增殖的MAPK通路可能在不同來源細胞中通路不同:JNK通路和p38通路可能分別是Jurkat細胞和NALM-6細胞中發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路;p38通路可能還部分參與了PTPN21基因促Reh細胞增殖的作用;PTPN21基因可能參與ALL細胞對柔紅霉素的耐藥,經(jīng)篩選驗證發(fā)現(xiàn)IL22RA1基因的表達上調(diào)可能參與PTPN21介導(dǎo)的耐藥。第二章應(yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)在急性淋巴細胞白血病細胞株Jurkat中敲除PTPN21基因?qū)υ鲋持芷诘恼{(diào)控作用目的:通過CRISPR-Cas9技術(shù)建立敲除Jurkat細胞的PTPN21基因的細胞系,研究敲除PTPN21基因是否抑制ALL細胞的增殖。方法:選擇Zhanglab MIT的CRISPR Design tool針對2號外顯子和13號外顯子分別進行g(shù)RNA的設(shè)計;以pX458質(zhì)粒作為gRNA的表達載體;以293T細胞作為目的細胞,利用T7E1實驗進行不同gRNA的剪切效率檢測;以核轉(zhuǎn)方式在Jurkat細胞中表達Cas9質(zhì)粒;流式細胞分選儀分選GFP表達陽性的細胞;極限稀釋法進行細胞單克隆的篩選,提取克隆的基因組DNA,PCR擴增后測序;針對出現(xiàn)雙信號峰的克隆,利用TA克隆進一步測序明確;利用流式細胞術(shù)檢測篩選獲得的克隆的凋亡和增殖周期。結(jié)果:通過T7E1實驗選擇分別針對2號外顯子和13號外顯子剪切效率最高的兩條gRNA進行Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建;通過測序篩選共獲得5個單等位基因突變和6個雙等位基因突變的克隆,建立了 Jurkat細胞敲除PTPN21基因的細胞系;敲除PTPN21基因后不影響Jurkat細胞的凋亡;敲除PTPN21基因后Jurkat細胞的S/G2/M期比例顯著性低于對照組,表明敲除PTPN21基因抑制了 Jurkat細胞的增殖。結(jié)論:建立了Jurkat細胞敲除PTPN21基因的細胞系,敲除PTPN21基因后Jurkat細胞的增殖被抑制。
[Abstract]:Objective : To investigate the role of PTPN21 gene in acute lymphoblastic leukemia ( ALL ) and to explore the role of PTPN21 gene in ALL . The results showed that PTPN21 gene could effectively reverse the proliferation of PTPN21 and inhibit the proliferation of ALL cells . Two gRNAs with the highest shearing efficiency of exon 2 and exon 13 were constructed by the T7E1 experiment . Five single allelic mutations and six double - allelic variants were obtained by sequencing . The cell lines of the PTPN21 gene were constructed by knock - out PTPN21 gene . The S / G2 / M phase ratio of the cells transfected with PTPN21 gene was significantly lower than that of the control group , suggesting that the knock - out PTPN21 gene inhibited the proliferation of pPN21 gene . Conclusion : The cell line of the PTPN21 gene was established , and the proliferation was inhibited after the PTPN21 gene was knocked out .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.71

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1 朱妮;PTPN21基因在急性淋巴細胞白血病的增殖周期和耐藥中的作用和機制研究[D];浙江大學(xué);2017年

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本文編號：1448972