本文關(guān)鍵詞： kigamicin 生物合成路徑 PCR-Targeting　出處：《福建師范大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：Kigamicin是從放線菌中分離到的具有抗細(xì)菌和抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物。其獨(dú)特的生物學(xué)活性表現(xiàn)為能夠抑制營養(yǎng)饑餓狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞,而對正常營養(yǎng)生長狀態(tài)的細(xì)胞沒有影響。因此,kigamicin可以作為開發(fā)特異性抗癌藥物的重要來源。本論文通過對kigamicin的生物合成途徑的研究,而研究過程中著重闡明kigamicin合成過程中新物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。從而進(jìn)一步了解kigamicin的化學(xué)結(jié)構(gòu)與功能上的對應(yīng)關(guān)系。為了研究orf60在kigamicin的生物合成中的功能,本論文開展了以下工作：首先,我們對orf0基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,推測其編碼的蛋白可能是一種單加氧酶。然后我們以PIJ778為模板采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出一段與orf60兩端同源且?guī)в袎延^霉素抗性的置換片段。隨后將這段置換片段以及整合型質(zhì)粒pLL59一起轉(zhuǎn)化到E.coil BW25113/pIJ 790中,通過PCR-Targeting技術(shù)我們得到重組質(zhì)粒并命名為pLL200,通過抗性篩選以及PCR驗(yàn)證,證明orf0基因敲除成功。然后,我們將重組質(zhì)粒pLL200以及質(zhì)粒pLL68(含有激活因子)轉(zhuǎn)入天藍(lán)色鏈霉菌ML154,通過孢子接合轉(zhuǎn)移方法得到了突變菌株ML20068。通過對比突變株M120068和野生株ML154發(fā)酵產(chǎn)物HPLC-MS的檢測結(jié)果,發(fā)現(xiàn)突變株ML20068產(chǎn)生了[M+H]/Z=538 和 [M+H]/Z=513的兩個(gè)新組分。它們與kigamicin具有相同UV吸收光譜。它們可能是Kigamicin生物合成過程中的中間產(chǎn)物或衍生物。我們通過對發(fā)酵產(chǎn)物分離純化得到538組分12.6 mg和513組分9.0 mg。高分辨質(zhì)譜擬合它們的元素組成,確定538組分的分子式為C 28H27NO10,513組分的分子式為(26H24O11最后通過核磁共振解析其化學(xué)結(jié)構(gòu),我們得到了538組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。從而推測orf60在kigamicin的生物合成中的功能。
[Abstract]:Kigamicin is a natural product with anti-bacterial and anti-tumor activity isolated from actinomycetes. Its unique biological activity is that it can inhibit nutritional starvation of tumor cells. But there is no effect on the normal vegetative growth state of the cells. Kigamicin can be used as an important source for the development of specific anticancer drugs. In this paper, the biosynthesis pathway of kigamicin was studied. In order to study the chemical structure and function of kigamicin, the chemical structure of the new substance in the process of synthesis of kigamicin was elucidated in order to understand the corresponding relationship between the chemical structure and the function of kigamicin. Function of f60 in biosynthesis of kigamicin. The main work of this thesis is as follows: firstly, we do bioinformatics analysis of orf0 gene. We speculated that the protein encoded by it might be a monooxygenase. Then we used PIJ778 as template and PCR technique to amplify a displacement fragment with spectinomycin resistance and homologous to both ends of orf60. The replacement fragment and the integrated plasmid pLL59 were transformed into E. coil. In BW25113/pIJ 790. The recombinant plasmid pLL200was obtained by PCR-Targeting technique. It was proved that orf0 gene knockout was successful by resistance screening and PCR validation. We transferred recombinant plasmid pLL200 and plasmid pLL68 (containing activator) into Streptomyces ML154. The mutant strain ML20068was obtained by spore conjugation transfer method. The detection results of the mutant M120068 and the wild strain ML154 fermentation product HPLC-MS were compared. It was found that the mutant ML20068 produced. [M H] / R ZN 538 and. [M. Two new components of H] / R ZN 513. They have the same UV absorption spectrum as kigamicin. They may be intermediate products or derivatives of Kigamicin biosynthesis. We obtained 538 component 12.6 by separating and purifying the fermentation product. Mg and 513 components 9.0 mg / g. Their elemental compositions were fitted by high resolution mass spectrometry. The molecular formula of the 538 component was determined to be C28H27NO10O513. The molecular formula of the 538 component was determined as C28H27NO10O513. Finally, the chemical structure of the 538 component was elucidated by nuclear magnetic resonance (NMR). The chemical structure of the 538 component was obtained and the function of orf60 in the biosynthesis of kigamicin was inferred.
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TQ460.1;TQ929

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本文編號：1444966