本文關(guān)鍵詞： 柿果實 脂氧合酶 免疫亞細胞定位 啟動子 非生物脅迫 轉(zhuǎn)錄組　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：脂氧合酶(LOX,EC1.13.11.12)廣泛存在植物體內(nèi),啟動生物膜上不飽和脂肪酸(PUFAs)發(fā)生過氧化反應(yīng),生成一些列生物活性物質(zhì),在植物生長發(fā)育、果實成熟衰老和脅迫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要功能。柿(Diospyros kaki L.)果實富含營養(yǎng)物質(zhì)且風味獨特,是我國北方重要的園藝經(jīng)濟產(chǎn)品。但是柿果實采后易軟化,影響其鮮果的運輸,造成嚴重的經(jīng)濟損失。本研究以不同耐貯性柿品種果實為材料,分析了9-LOX與果實成熟軟化的關(guān)系及其對采后脅迫的應(yīng)答,探討了13-LOX在果實成熟軟化中的作用。主要獲得了以下的研究結(jié)果:1、利用RACE技術(shù),從‘干帽盔’柿果實克隆獲得2個LOX基因,DkLOX3(KF035131)和DkLOX4(KF035132)。同源基因聚類分析表明DkLOX3/4均屬于9-LOX。柿果實DkLOX3/4基因在大腸桿菌中表達,通過Western blotting鑒定和蛋白純化,獲得DkLOX3/4融合蛋白。體外酶促反應(yīng)試驗分析表明,DkLOX3/4具有脂氧合酶活性。2、利用qRT-PCR檢測不同耐貯性柿品種(耐貯性弱的‘富平尖柿’、耐貯性中等的‘火柿’和耐貯性較好的‘干帽盔’)果實成熟軟化過程中DkLOX3/4基因的表達模式,并對‘富平尖柿’和‘干帽盔’進行丙烯和1-MCP處理,來探討DkLOX3/4與乙烯的關(guān)系。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),DkLOX3/4基因在不同柿品種果實成熟軟化過程中大量表達,并且具有不同的表達模式。DkLOX3基因表達量顯著高于DkLOX4。此外,與DkLOX4相比,DkLOX3基因表達被丙烯處理顯著上調(diào),被1-MCP處理顯著下調(diào)。3、利用掃描電鏡觀察貯藏期間‘富平尖柿’和‘干帽盔’果皮結(jié)構(gòu)變化特性。果皮表面電鏡觀察發(fā)現(xiàn),2個柿品種果實的果皮表面均沒有皮孔結(jié)構(gòu);采收當天果皮角質(zhì)層上均沒有明顯的微裂紋特征,貯藏12 d后微裂紋數(shù)量明顯增多且加深�！黄郊馐痢さ奈⒘鸭y要比‘干帽盔’上的深。4、利用免疫膠體金結(jié)合透射電鏡,探討‘富平尖柿’和‘干帽盔’果實成熟軟化過程中DkLOX3/4與細胞超微結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),貯藏12 d后,與‘干帽盔’相比,大量的DkLOX3金顆粒在‘富平尖柿’果肉細胞中迅速積累;但在相同時期2個柿品種果肉細胞標記的DkLOX4金顆粒數(shù)目均無明顯變化。此時‘富平尖柿’比‘干帽盔’成熟軟化快。這些結(jié)果表明DkLOX3在細胞超微結(jié)構(gòu)改變中發(fā)揮重要作用,從而促進柿果實的成熟軟化。5、利用qRT-PCR分析‘富平尖柿’果實成熟軟化過程中DkLOX3/4基因?qū)Σ煌锢砗屯庠醇に靥幚淼捻憫?yīng)模式。分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同處理后,DkLOX3基因的表達模式基本與乙烯釋放量的變化趨勢相一致。機械損傷和外源ABA處理顯著誘導(dǎo)DkLOX3基因的表達;而低溫、外源SA和GA處理抑制了DkLOX3基因的表達。但特別的是,外源MeJA處理后,DkLOX3基因的表達模式不同于乙烯釋放量的變化趨勢。而DkLOX4基因與DkLOX3不同,除外源ABA處理抑制DkLOX4基因的表達,其他處理都不同程度的誘導(dǎo)DkLOX4基因的表達。6、利用染色體步移法克隆獲得DkLOX3/4基因啟動子序列,命名為pDkLOX3和pDkLOX4,基因登錄號分別為KX779272和KX792109。煙草瞬時轉(zhuǎn)化試驗證明,DkLOX3/4基因啟動子具有轉(zhuǎn)錄活性。另外,構(gòu)建DkLOX3/4基因啟動子缺失體探討啟動子如何調(diào)控不同9-LOX基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)。GUS活性分析表明,不同非生物脅迫都能誘導(dǎo)DkLOX3/4基因啟動子的活性。根據(jù)DkLOX3/4基因啟動子缺失體對不同非生物脅迫的響應(yīng)情況,推測TGACG motif可能在DkLOX3基因?qū)eJA響應(yīng)中發(fā)揮重要作用;TCA element在SA對DkLOX3/4基因啟動子的誘導(dǎo)中具有重要作用;TATC-box、P-box和GARE motif在GA對DkLOX4基因啟動子的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。7、利用RNA-seq技術(shù)對丙烯和1-MCP處理的‘富平尖柿’果實進行轉(zhuǎn)錄組分析。在不同處理柿果實轉(zhuǎn)錄組對比分析中獲得了41,301條差異表達基因,統(tǒng)計丙烯處理果中基因差異表達倍數(shù)在2以上的基因有1868個,1246個基因被乙烯顯著上調(diào),622個基因被顯著下調(diào)。進一步根據(jù)KEGG富集分析,篩選出柿果實中與LOX pathway相關(guān)的關(guān)鍵基因。8、探討了柿果實LOX途徑中13-LOX pathway在非生物脅迫應(yīng)答中的作用。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,克隆獲得13-LOX pathway相關(guān)關(guān)鍵基因DkLOX5/6、DkHPL和DkAOS。同源基因聚類分析表明DkLOX5/6均屬于13-LOX;DkHPL屬于13-HPL,DkAOS屬于13-AOS。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),機械損傷和外源MeJA處理可以顯著誘導(dǎo)DkLOX5/6、DkHPL和DkAOS基因表達升高;低溫處理抑制DkLOX5/6基因的表達,誘導(dǎo)DkAOS、DkHPL和DkERF22基因表達升高;另外,外源ABA處理誘導(dǎo)DkLOX5/6、DkAOS、DkHPL和DkERF26基因表達升高。
[Abstract]:In this study , two LOX genes , DkLOX3 ( KF035131 ) and DkLOX4 ( KF035132 ) were obtained from persimmon fruits . The expression pattern of DkLOX3 / 4 gene was significantly higher than that of DkLOX3 . DkHPL belongs to 13 - HPL , DkHPL belongs to 13 - HPL , and DkHPL belongs to 13 - HPL . DkHPL belongs to 13 - HPL , DkHPL and DkHPL , DkHPL and DkERF22 gene expression are increased , and the expression of DkLOX5 / 6 gene is induced by low temperature treatment .

【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S665.2

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