本文關(guān)鍵詞：工業(yè)微生物代謝途徑調(diào)控的基因敲除策略，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

生物工程學(xué)報
journals.im.ac.cn cjb@im.ac.cn

Chin J Biotech 2010, September 25; 26(9): 1199?1208 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 ?2010 CJB, All rights reserved.

代謝工程

工業(yè)微生物代謝途徑調(diào)控的基因敲除策略
于慧敏 1，馬玉超 2
1 清華大學(xué)化工系生物化工研究所，北京 100084 2 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083

摘

要: 基因敲除技術(shù)是一項重要的分子生物學(xué)技術(shù)，在工業(yè)微生物代謝工程中具有廣泛應(yīng)用。以下從基因敲除技術(shù)

的遺傳重組原理出發(fā)，總結(jié)了基因敲除策略的類型、特征和應(yīng)用，重點介紹了采用線性雙鏈 DNA 的 λ Red 同源重組系 統(tǒng)、使用環(huán)狀質(zhì)粒載體介導(dǎo)的單交換或雙交換同源重組策略以及采用轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座重組等幾種主要的基因敲除方 法，進一步展望了基因敲除技術(shù)的發(fā)展前沿和應(yīng)用前景。 關(guān) 鍵 詞 : 基 因 敲 除 ， λ Red 重 組 系 統(tǒng) ， 單 交 換 和 雙 交 換 ， 同 源 重 組 ， 轉(zhuǎn) 座 重 組

Gene knockout strategies for metabolic pathway regulation in industrial microbes
Huimin Yu1, and Yuchao Ma2
1 Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China 2 College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

Abstract: Gene knockout, an important technology in molecular biology, has been broadly applied in industrial microbial
metabolic engineering. From the basic mechanism of DNA recombination, we summarized and compared in this review different gene knockout strategies. Three most hot and important approaches, including the λ Red recombination system using the linear dsDNA as recombination substrate, the single or double crossover homologous recombination using the circular plasmid DNA as substrate, and the transposase mediated transposition recombination, were summarized in detail. Developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.

Keywords: gene knockout, λ Red recombination system, single or double crossover, homologous recombination, transposition
recombination

生命的代謝活動是通過活細胞和細胞群的代謝 網(wǎng) 絡(luò) 進 行 的， 后 者 由 一系 列 酶 催 化反 應(yīng) 以 及 特異 性 的 膜 轉(zhuǎn) 移系 統(tǒng) 構(gòu) 成 。然 而 ， 細 胞自 身 固 有 的這 種 代 謝 網(wǎng) 絡(luò)相 對 于 實 際應(yīng) 用 而 言 ，其 遺 傳 特 性通

常并非最佳，這就需要對細胞的代謝途徑進行有目 的的修飾與調(diào)控。1991 年，Bailey 和 Stephanopoulos 在 Science 上分別發(fā)表重要文章[1-2]， 提出了 “Metabolic Engineering”的概念，綜述了代謝工程的應(yīng)用實例，

Received: May 11, 2010; Accepted: August 2, 2010 Supported by: National High Technology Research and Development Program (863 Program) (No. 2007AA02Z201), National Basic Research Program (973 Program) (No. 2007CB714304), National Natural Science Foundation of China (No. 20976094). Corresponding author: Huimin Yu. Tel: +86-10-62795492; E-mail: yuhm@tsinghua.edu.cn 國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863 計劃) (No. 2007AA02Z201)， 國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973 計劃) (No. 2007CB714304)， 國家自然科學(xué)基金 (No. 20976094) 資助。

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指出了存在的問題及發(fā)展的方向，，被認為是代謝工 程向一門系統(tǒng)的學(xué)科發(fā)展的起點。 簡單地說，代謝工程就是“一種理解并利用代 謝過程的方法” [3] ；具體而言，代謝工程就是利用 基因工程技術(shù)或其他物理、化學(xué)方法對細胞的代謝 途徑進行精確地修飾與改造，對細胞內(nèi)目標(biāo)物質(zhì)的 代謝流進行擴展、減小、阻斷或構(gòu)建新的代謝途徑， 從而有目的、有理性地改變微生物原有代謝特性， 改 進 或 者 構(gòu)建 新 的 微 生物 表 型 ， 并與 微 生 物 基因 調(diào) 控 、 代 謝調(diào) 控 及 生 化工 程 相 結(jié) 合， 提 高 目 的代 謝產(chǎn)物活性或產(chǎn)量、或合成新的代謝產(chǎn)物的工程技 術(shù)科學(xué)
[1-2]

組 (或異常重組) 等。 其中， 同源重組是指兩個 DNA 分子之間，通過精確地相互交換片段達到序列重排 的目的。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用 DNA 同源重組 (Homologous recombination) 原理，利用 限制性內(nèi)切酶、 連接酶以及 PCR 技術(shù)等對線性 DNA 片段或質(zhì)粒等基因工程載體進行改造，并導(dǎo)入目標(biāo) 宿主中，使宿主完成對目的基因或基因簇的諸如片 段缺失、插入突變、定點突變等一系列的修飾操作。 關(guān)于同源重組的分子機制，目前普遍接受的有 3 種模型，即 Holliday 雙鏈侵入模型、MeselsonRadding 單鏈侵入模型和 Szostak 雙鏈斷裂修復(fù)模 型 [6-7]。其中，Holliday 模型中提出的 Holliday 連接 體 (Holliday junction) 結(jié)構(gòu)是 3 個模型所共有的重 組中間體。越來越多的研究證明，這 3 種模型實際 上是相互聯(lián)系和相互補充的，而雙鏈斷裂引發(fā)的同 源重組是生物體內(nèi)更為普遍的遺傳現(xiàn)象 [6]。 以大腸桿菌為例，大腸桿菌同源重組過程可分 為 4 個主要階段：起始、同源配對和鏈交換、異源 雙鏈擴展 (分支遷移) 以及 Holliday 連接體的解 離 [6-7]。在這一過程中，至少有 25 種不同的蛋白質(zhì) 參與作用。其中，除最基本的 DNA 解旋酶、DNA 拓撲異構(gòu)酶、DNA 聚合酶、DNA 連接酶等之外， 具有特殊作用的包括 RecBCD、 RecA、 SSB、 RuvAB、 RuvC 以及順式作用重組熱點 χ，也叫 Chi 位點等， 最重要的是 RecBCD 和 RecA 蛋白。 同源重組的起始最突出的特點就是單鏈 DNA 的產(chǎn)生，它是同源重組的底物。RecBCD 酶是一種 多功能的酶，它同時具有解旋酶、外切核酸酶、單 鏈內(nèi)切酶活性，并能以相當(dāng)高的頻率啟動含有 Chi 位點的 DNA 重組。 位點 (5′-GCTGGTGG-3′) 天 Chi 然存在于大腸桿菌的染色體 DNA 中，約 5 kb 長的 序列中出現(xiàn)一次。 這些 Chi 位點與 RecBCD 酶作用， 能夠促進具有 3′-OH 末端的單鏈 DNA 的產(chǎn)生。如 圖 1 所示，由 RecA 蛋白促進的同源配對和鏈交換 是同源重組的核心。RecA 蛋白是單鏈結(jié)合蛋白，是 同源重組過程中最重要的蛋白質(zhì)之一，它大量地結(jié) 合于單鏈 DNA 上 (SSB 蛋白輔助)，并迅速啟動與 之結(jié)合的單鏈 DNA 尋找同源雙鏈 DNA，實現(xiàn)同源 配對。該過程也稱為聯(lián)會 (Synapsis)。同源配對后，

。

由于生物系統(tǒng)的復(fù)雜性以及大量生物學(xué)數(shù)據(jù)的 未知性，這種以理論為基礎(chǔ)的系統(tǒng)代謝工程方法的 應(yīng)用有時會受到限制。在此條件下，以基因組規(guī)模 的分子生物學(xué)實驗工具為基礎(chǔ)的反向代謝工程方法 進一步發(fā)展起來。反向代謝工程 (Inverse metabolic engineering，IME) 的概念最初由 Jay Bailey 于 1996 年提出 。首先，識別、構(gòu)建或計算一種目標(biāo)表型； 其次，確定形成該表型的基因或環(huán)境因子；最后， 通過直接的基因操作或環(huán)境調(diào)控將該表型轉(zhuǎn)而賦予 其他菌株或生物體 。簡單而言，反向代謝工程就 是從表型到基因型、再從基因型到表型的基因重組 策略。 無論是代謝工程還是反向代謝工程研究，基因 敲除都是代謝途徑調(diào)控的主要方法之一�；蚯贸� 技術(shù)是 20 世紀(jì) 80 年代發(fā)展起來的一項重要的分子 生物學(xué)技術(shù)，是通過一定的方法使細胞中特定的基 因失活或缺失的技術(shù)。它具有定位性強、插入基因 隨染色體 DNA 穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點。利用基因敲除技 術(shù)，不僅可以研究被敲除基因的生物學(xué)功能，還可 以進行功能基因的插入及染色體基因的替換，進而 可以阻斷微生物細胞的代謝旁路，減弱毒/副作用， 強化目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量或質(zhì)量，從而成為具有重要工 業(yè)應(yīng)用價值的微生物細胞工廠研究中的重要內(nèi)容。
[5] [4]

1 基因敲除技術(shù)的基本原理
遺傳重組是指不同 DNA 配對后的交換和重排 過程 ，包括同源重組、位點特異性重組和轉(zhuǎn)座重
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[6]

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單鏈 DNA 便能侵入雙鏈 DNA 將其中的同源單鏈置 換出來， 自己與互補鏈進行堿基配對， 并產(chǎn)生 D-環(huán)， 最終形成 Holliday 連接體；繼而產(chǎn)生異構(gòu)化，形成 異源雙鏈。在 RuvA、RuvB 以及 RuvC 等蛋白的參 與下，異源雙鏈的擴展以及 Holliday 連接體的解離 順利完成，通常會產(chǎn)生兩側(cè)基因有交換以及兩側(cè)基 因無交換這兩種結(jié)果。

表1

基于同源重組的基因敲除策略

Table 1 Homologous recombination based gene knockout strategies
Target Strategies substrates Linear Using single-stranded oligonucleeotide ssDNA directly as target recombination sequence Linear 1) RecA dependent and Chi stimulated dsDNA recombination: introducing Chi site at the end of the linear dsDNA as recombination substrate for not being degraded by RecBCD, also improving the RecBCD function 2) Red/ET recombination: introducing red recombinase of lambda phage or RecET of RAC phage to perform the recombination without RecA 3) RecA-assisted lambda red recombination Circular 1) Non-replicated suicide plasmid or dsDNA unstable plasmid recombination 2) Temperature sensitive plasmid recombination 3) Antibiotics/SacB mediated single or double crossover recombination References [9]

[10-11]

[12-14] [15]

[16-17] [18] [19-21]

線性單鏈 DNA 敲除策略不但打靶載體易于構(gòu) 建，且其重組效率是雙鏈 DNA 的 10~100 倍 [9,11]。
圖1 大腸桿菌同源重組過程中 RecBCD、RecA 和 SSB
[8]

采用線性雙鏈 DNA 進行同源重組， 是近年來基 因敲除方法的熱點之一。其優(yōu)點是可以避免較為繁 瑣的基因克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建步驟，而直接采用 PCR 方法擴增獲得目標(biāo)同源重組片段。然而，線性 雙鏈 DNA 易于被細胞內(nèi)的 RecBCD 酶降解， 為了解 決上述問題，可以在線性雙鏈 DNA 的兩側(cè)引入 Chi 位點，保護 DNA 不被 RecBCD 消耗，并能強化 RecBCD 介導(dǎo)的同源重組效率 [10-11] 。在應(yīng)用越來越 廣泛的 Red/ET 重組系統(tǒng)中，Gam (γ) 蛋白的引入同 樣是為了抑制宿主菌的重組蛋白 RecBCD 的線性雙 鏈 DNA 外切酶活性，從而協(xié)助 Exo 和 Beta 蛋白完 RecA 輔助的 λ Red 重組則可進一步 成同源重組 [14]。 提高重組效率 [15]。 構(gòu)建環(huán)狀質(zhì)粒載體進行目標(biāo)基因敲除的方法， 是實現(xiàn)微生物基因敲除的經(jīng)典策略，主要通過微生 物 本 身 的 RecA 重 組 系 統(tǒng) ( 主 要 包 括 RecA 和 RecBCD 等蛋白) 發(fā)揮作用。RecA 蛋白是單鏈結(jié)合 蛋白，促進各類 DNA 分子間的同源聯(lián)會、配對、鏈 交換和分支遷移。 RecBCD 是由 RecB、 RecC 和 RecD 三個蛋白組成的復(fù)合體，它能與雙鏈切口結(jié)合使 DNA 鏈解開， 并在 Chi 位點形成單鏈， 然后由 RecA
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蛋白的功能

Fig. 1 Function of RecBCD, RecA and SSB during the homologous recombination in Escherichia coli[8]. RecBCD enzyme has helicase and nuclease activities. Unwinding of DNA ahead of the moving RecBCD and slower rewinding behind create single-stranded bubbles. One strand is cleaved when the enzyme encounters a Chi site, forming a single-stranded tail. RecA and SSB coat the tail and promote invasion of another DNA duplex, initiating the homologous recombination.

經(jīng)典的基因敲除策略正是利用上述同源重組基 本原理，通過體外改造一定長度/形式的基因，與細 胞染色體上的靶基因發(fā)生同源重組 (插入或置換)， 從而改變細胞的遺傳特性。

2 基因敲除策略的類型、特征和應(yīng)用
從上述同源重組的基本原理出發(fā)，分別針對同 源重組的底物類型 (單鏈/雙鏈、線性/環(huán)狀)、重要 蛋白 (RecA 酶、RecBCD 酶等及噬菌體中具有相似 功能的酶) 和功能位點 (Chi 位點) 等進行分子設(shè) 計，即可開發(fā)出各種不同的基因敲除方法，如表 1 所示。根據(jù)同源重組載體的不同，可以把基因敲除 方法分為線性單鏈 DNA (ssDNA)、線性雙鏈 DNA (dsDNA) 以及環(huán)狀雙鏈 DNA (質(zhì)粒載體) 等 3 類。

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蛋白促進同源重組。由于 RecBCD 具有核酸外切酶 V 的活性， 所以線性 DNA 分子在細菌體內(nèi)會被降解。 因此， 必須通過環(huán)狀質(zhì)粒載體克隆來完成同源重組片 段的分子設(shè)計和構(gòu)建。通常情況下，實現(xiàn)同源重組的 同源臂長度都在數(shù)百 bp 或更長。插入型敲除可以通 過同源單交換實現(xiàn)， 而置換型敲除則需要通過同源雙 交換來實現(xiàn)。在上述過程中，為了強化同源重組發(fā)生 的效率，良好區(qū)分單交換和雙交換型重組菌株，并使 發(fā)生交換后的質(zhì)粒從宿主菌中快速去除， 可以采用在 質(zhì)粒載體上相應(yīng)設(shè)計兩個不同的正負篩選標(biāo)記及構(gòu) 建自殺型或溫度敏感型質(zhì)粒載體等策略[16-21]。 隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外， 位點特異性重組和轉(zhuǎn)座重組引起的基因插入突變也 逐漸受到重視。下面就細菌、放線菌等工業(yè)微生物 中應(yīng)用的 3 種重要的基因敲除策略進行詳細的介紹 和討論。

用相似，所以經(jīng)常和 Red 重組一起被稱為 Red/ET 重組系統(tǒng)。 Datsenko 和 Wanner 等以 Red 重組系統(tǒng)為核心 開發(fā)了一套輔助質(zhì)�；蚯贸绦�，以其諸多優(yōu)點 和較為廣泛的普適性被大量運用到基因敲除的研究 中 [13,24] 。他們運用這套基因敲除程序在大腸桿菌中 完成了 40 個以上不同染色體基因的敲除而未產(chǎn)生 任何差錯。以 β-xylosidase 基因 yagH 的敲除為例， 應(yīng)用 λ Red 質(zhì)粒重組系統(tǒng)進行基因敲除的基本流程 如圖 2 所示，其中，使用的輔助質(zhì)粒共有 3 個，一 個是帶有兩個 FRT 片段及中間嵌入抗性片段的抗 性片段模板質(zhì)粒 pKD13； 一個是可以表達 Red 重組 酶的同源重組輔助質(zhì)粒 pKD46；另外一個是帶有 FLP 酶表達系統(tǒng)的抗性去除輔助質(zhì)粒 pCP20。其中， pKD46 和 pCP20 輔助質(zhì)粒都是溫敏型復(fù)制子，在 42℃下質(zhì)粒復(fù)制被抑制并在傳代過程中丟失。 由圖 2 可見，使用輔助質(zhì)粒的 Red 重組系統(tǒng)一 般包括 4 個主要步驟。第 1 步，是以 pKD13 為模板 的基因擴增，通過 PCR 引物設(shè)計，引入待敲除目標(biāo) 基因兩側(cè)的延伸同源序列 (約 50 bp)，獲得中間為 Kan 抗性基因和 FRT 標(biāo)記、兩側(cè)為短同源臂的線性 同源重組片段。第 2 步是核心的同源重組，包括將 攜帶 Red 重組酶的質(zhì)粒 pKD46 轉(zhuǎn)入目標(biāo)細胞、 表達 了 Red 重組酶的感受態(tài)細胞的制備、同源片段的電 轉(zhuǎn)化導(dǎo)入及同源重組發(fā)生等幾個關(guān)鍵步驟。其中， 感受態(tài)細胞的制備一定要在阿拉伯糖誘導(dǎo)質(zhì)粒 pKD46 的 ParaB 啟動子高效表達 γ、β 和 α 蛋白之后； 而質(zhì)粒 pKD46 的去除則采用 42℃熱激偶合氨芐青 霉素抗性負篩選的策略。同源重組之后，Kan 抗性 基因即成功插入染色體，并替代原 yagH 基因。第 3 步是成功敲除目標(biāo)基因的陽性重組子的菌落 PCR 篩 選和驗證。最后一步，是在陽性重組子的細胞中轉(zhuǎn) 入表達 FLP 重組酶的輔助質(zhì)粒 pCP20，F(xiàn)LP 重組酶 直接作用于抗性基因外延兩端的兩個對應(yīng) FRT 區(qū) (FLP 的識別目標(biāo)) 并再次發(fā)生同源重組，用一個 FRT 片段代替原有的兩個 FRT 片段及中間的抗性基 因，從而達到去除抗性基因的目的。質(zhì)粒 pCP20 的 去除則同樣采用 42℃熱激偶合抗生素抗性負篩選的 策略。

3 幾種高效的基因敲除策略
3.1 采用線性雙鏈 DNA 的 Red/ET 重組系統(tǒng)
Red 重組系統(tǒng)原來是屬于 λ 噬菌體的重組系統(tǒng)， 其編碼基因 exo 和 bet 置于 PL 操縱子的控制之下。 exo 基因的產(chǎn)物 Exo 蛋白 (也稱為 Red α 蛋白) 是 λ 核酸外切酶，它可將 dsDNA 的 5′端切開，產(chǎn)生 3′ 突出端。bet 基因編碼的 β 蛋白，是具有退火和鏈侵 入功能的單鏈結(jié)合蛋白。當(dāng)發(fā)生同源重組時，帶有 同源臂的供體 DNA 分子首先經(jīng) Exo 蛋白 (Red α) 作用而使其兩端形成單鏈懸突；之后 β 蛋白形成環(huán) 形結(jié)構(gòu)并結(jié)合到 3′突出末端，對 ssDNA 進行保護， 并依靠被結(jié)合的同源臂進行配對重組。為起到這一 作用，β 蛋白只需要結(jié)合 35 bp 的單鏈核苷酸即可。 與傳統(tǒng)的大腸桿菌同源重組系統(tǒng)相比，Red α 蛋白 的功能類似于 RecBCD，而 Red β 蛋白的功能類似 于 RecA
[22]

。 因 此 ， Red 重 組 系 統(tǒng) 可 以 不 依 賴 于
[15]

RecA 蛋白而完成同源重組。但是，缺失 RecA 不僅 使重組效率下降， 而且載體穩(wěn)定性也會有所下降 。 另外，Stewart 等在 1998 年還報道了一種通過 在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達 Rac 噬菌體的 RecE 和 RecT 蛋白來介導(dǎo)同源重組的 ET 重組系統(tǒng)
[23]

。其中 RecE

和 Red α 蛋白的作用相似，RecT 和 Red β 蛋白的作
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圖2

應(yīng)用 λ Red 質(zhì)粒重組系統(tǒng)進行 yagH 基因敲除的流程示意圖

Fig. 2 Steps of yagH gene knockout using the plasmid- assistant λ Red recombination. Step 1: preparation of PCR recombination product using pKD13 as template and yagH1/yagH2 as primers. pKD13: Template plasmid. FRT: FLP recombinase recognition target. yagH1, yagH2: yagH extension primers around 50 bp. k1, k2: Kanamycin (Kan) test primers. Step 2: gene knock-out by homogeneous recombination via electroporation, transforming the purified PCR product from step 1 into competent cells of the target strain expressed the Red recombinase (Red α, β and γ proteins) by plasmid pKD46 (Amp). yagG: upstream gene of yagH in chromosome. yagI: downstream gene of yagH in chromosome. Step 3: colony PCR verification of the target recombinant with inserted Kan resistance. Primer-pairs of “Valid sense-k2” and “k1-Valid antisense” were used for target identification. Step 4: removal of the flanked Kan resistance cassette via helper plamsid pCP20 (Amp, Cm). Primer pairs of “Valid sense-k2” and “Valid sense-valid antisense” were used for target strain identification. The positive recombinant with removed Kan gene would show no band via primers “Valid sense-k2”, and 600 bp band via primers “Valid sense-valid antisense”.

這套質(zhì)粒輔助 λ Red 重組酶基因敲除系統(tǒng)有如 下優(yōu)點：操作過程簡便，無須構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒， 直接通過線性片段轉(zhuǎn)化實現(xiàn)同源重組，避免了繁瑣 的酶切及連接過程；可去除抗性篩選基因，用同一 套抗性輔助質(zhì)粒系統(tǒng)可進行多基因疊加敲除；只需 很短的同源片段 (30~50 bp) 即可完成同源重組， 節(jié) 省了人力物力，尤其是在基因序列不很清楚的情況 下，可根據(jù)有限的基因序列信息設(shè)計同源片段實施 基因敲除；同源重組效率高，準(zhǔn)確度高。目前，這 套系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大腸桿菌、痢疾桿菌、鏈霉 菌等多種微生物的基因敲除中 [25-26]。

同源序列。在實施目標(biāo)基因敲除過程中，只發(fā)生一 次同源重組的，稱為同源單交換。該方法簡單、易 行，單交換發(fā)生后整個質(zhì)粒載體插入到目標(biāo)基因內(nèi) 部，同時產(chǎn)生兩個拷貝的無活性目標(biāo)基因。其示意 圖如圖 3A 所示。 在具體實施過程中，需要注意的是構(gòu)建同源重 組載體時，目標(biāo)基因片段要選擇中間一段，即不含 有起始密碼子 ATG 和終止密碼子 TGA。一般情況 下，單交換比較穩(wěn)定，回復(fù)突變的概率僅為 10?4~ 10?5/代 [20] 。馬玉超等利用此法成功敲除了丙烯酰胺 生產(chǎn)菌株紅色紅球菌的副產(chǎn)物基因 [27]。 顧名思義，同源重組雙交換就是要通過兩次單 交換才能達到敲除目標(biāo)基因的目的，又分為缺失突 變和插入突變兩種類型，如圖 3B 和圖 3C 所示。缺 失突變是指基因敲除后使基因組上的目標(biāo)基因缺失
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3.2

使用環(huán)狀質(zhì)粒載體介導(dǎo)的同源單交換和雙交
使用環(huán)狀質(zhì)粒載體進行基因敲除的首要條件是

換策略
要選擇宿主細胞的自殺質(zhì)粒載體來攜帶目標(biāo)基因的

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編碼區(qū)中的某一段而達到失活目標(biāo)基因的目的；插 入突變則是指基因敲除后使基因組上的目標(biāo)基因內(nèi) 部插入額外一個基因而達到目標(biāo)基因失活的目的。 為了便于后期篩選雙交換重組子，額外插入的基因 通常為抗生素抗性基因。

敏感，從而促進同源重組的發(fā)生和載體序列丟失， 極大地提高篩選效率。SacB 是 Bacillus subtilis 的果 聚糖蔗糖酶 [28]， 可轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)生果糖并合成果聚糖， 在革蘭氏陰性菌中，果聚糖在細胞周質(zhì)空間大量積 累，會堵塞周質(zhì)空間而使細菌致死。當(dāng)以 SacB 為負 篩選標(biāo)記時，在添加蔗糖條件下，只有發(fā)生同源重 組雙交換的細胞才能夠存活。由于較為普遍的適用 性和篩選方法的簡單性，許多革蘭氏陰性細菌均采 用 sacB 基因作為負篩選標(biāo)記。另外，也有此系統(tǒng)成 功應(yīng)用于革蘭氏陽性菌的報道 [29]，此系統(tǒng)的優(yōu)點是 可以在不引入抗生素抗性的基礎(chǔ)上連續(xù)高效地敲除 多個基因。 目前，除了大腸桿菌、酵母菌等一些模式菌株 的遺傳轉(zhuǎn)化效率較高、方法簡便外，其他一些菌株 的遺傳背景不是很清楚，需要用電轉(zhuǎn)化儀才能將質(zhì) 粒導(dǎo)入宿主細胞。所以，同源重組的另一個難點是 如何用簡便的方法將質(zhì)粒導(dǎo)入目標(biāo)基因的宿主細 胞。針對該難點，研究者可以將可移動原件 mob 引 入載體，從而使載體能夠通過簡單的細菌接合實驗 高效地導(dǎo)入細胞中。

3.3

采用轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座重組 基因轉(zhuǎn)座子 (Transposon，Tn) 是一種 DNA 序

列單元。它能夠隨機插入到細菌染色體的許多位點 上，使得插入位置的基因失活或突變 [6-7]。轉(zhuǎn)座子能 夠啟動不同類型的重組事件發(fā)生，還可從插入位點 脫落下來。在脫落時，可攜帶宿主基因組的一部分 DNA 片段，造成基因缺失。利用該特性，轉(zhuǎn)座子被 廣泛應(yīng)用于基因敲除研究中，成為改良菌種的新技 術(shù)。典型的轉(zhuǎn)座子其兩端多為兩個顛倒重復(fù)序列
圖3 應(yīng)用環(huán)狀質(zhì)粒載體的同源單交換和雙交換策略

(IS 序列)，在重復(fù)序列之間有編碼抗生素的基因及 轉(zhuǎn)座酶。常見的轉(zhuǎn)座子有 Tn5、Tn10、Tn916 等。 其中，Tn916 具備廣泛的寄主范圍，可以應(yīng)用于多 種革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌。轉(zhuǎn)座子插入后穩(wěn) 定性好，不容易發(fā)生回復(fù)突變。 采用基因轉(zhuǎn)座子對目標(biāo)基因組進行隨機敲除， 構(gòu)建基因敲除突變庫，然后對目標(biāo)突變庫進行高通 量篩選，獲得所需要的表型，是近來反向代謝工程 的研究熱點之一，其示意圖如圖 4 所示 [30]。

Fig. 3 Homologous single crossover and double crossover strategies using circular plasmid vector. (A) Gene knockout by homologous single crossover. (B) Gene knockout by homologous double crossover with lost internal sequence of target gene. (C) Gene knockout by homologous double crossover with inserted SAG marker. AG: antibiotic gene. SAG: second antibiotic gene.

同源雙交換的難點之一是如何提高第二次同源 重組的效率。針對該問題，可以采用合適的負篩選 標(biāo)記，使含載體序列的細胞對某些特殊的培養(yǎng)條件
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采用 TAIL-PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR) 方法 [33]或 EZ-Tn5? Insertion Kits 中專門設(shè)計 的測序定位引物，還可特異性地擴增轉(zhuǎn)座子 IS 序列 的側(cè)翼被敲除基因，從而鑒別或發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)表型特 征相關(guān)的功能基因，并構(gòu)建或重構(gòu)基因敲除前后各 表型相關(guān)的代謝途徑。根據(jù)這些新的基因型和代謝 途徑信息，反過來又可進一步提出理性設(shè)計策略， 構(gòu)建性能更加優(yōu)越的重組菌株。 轉(zhuǎn)座子基因敲除系統(tǒng)的缺陷是，基因插入過程 基 本 上 是 隨機 的 ， 一 般不 能 用 于 某一 特 定 基 因的 敲 除 ， 也 很難 在 基 因 組范 圍 內(nèi) 突 變所 有 的 基 因。 因此，通常將轉(zhuǎn)座子突變系統(tǒng)與直接突變的方法進 行互補。
圖 4 采用基因轉(zhuǎn)座子進行基因組隨機敲除突變庫構(gòu)建 和目標(biāo)表型篩選示意圖 [30]
Fig. 4 Construction of the transposon random gene knockout library and selection or screening of the target phenotype[30].

4 基因敲除技術(shù)的發(fā)展及展望
綜上所述，根據(jù)重組位點特征的不同，基因敲 除技術(shù)可以分為依賴于較長同源序列的同源重組、 依賴于短同源序列的位點特異性重組以及不依賴于 同源序列的轉(zhuǎn)座敲除等 3 種主要類型。其中，位點 特異性重組主要在酵母菌等真核生物中應(yīng)用。 隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)理論的發(fā)展，新的基 因敲除原理也在不斷的發(fā)掘和發(fā)現(xiàn)。最具代表性的 就是 RNA 干擾 (RNA interference，RNAi) 技術(shù) [34]。 RNAi 是指通過利用短片段的雙鏈 RNA 促使特定基 因的 mRNA 降解來高效、特異地阻斷特定基因的表 達，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因沉默的表型。由于少 量的雙鏈 RNA 就能阻斷基因的表達， 并且這種效應(yīng) 可以傳遞到子代細胞中，所以 RNAi 的反應(yīng)過程也 可以用于基因敲除。到目前為止，RNAi 技術(shù)作為基 因沉默的工具，被研究人員廣泛應(yīng)用到真核生物細 胞的功能基因組學(xué)、藥物靶點篩選、細胞信號傳導(dǎo) 通路分析、疾病治療等研究領(lǐng)域 [34] 。與傳統(tǒng)的基因 敲除技術(shù)相比，RNAi 技術(shù)具有投入少、周期短、操 作簡單等優(yōu)勢，具有良好的發(fā)展前景。 總結(jié)了細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等幾種重 要工業(yè)微生物中已經(jīng)成功應(yīng)用的基因敲除策略，見 表 2。
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對于敲除基因的篩選與鑒定， Badarinarayana 在 2001 年報道了一種應(yīng)用轉(zhuǎn)座子和自殺質(zhì)粒進行基 因插入敲除的新方法
[31]

。Hal Alper 等利用類似的

方 法 ， 成 功篩 選 并 鑒 定了 在 重 組 大腸 桿 菌 中 高產(chǎn) 番茄紅素所必須敲除的 3 個負調(diào)控基因；將這 3 個基因與理論預(yù)測的 4 個基因偶合起來進行不同 組合突變，獲得了 64 株敲除不同基因的突變株。 全局最優(yōu)突變株的番茄紅素的產(chǎn)率較原始菌株提高 了9倍
[30]

。

然而，由于轉(zhuǎn)座子自身編碼轉(zhuǎn)座酶，從而遺傳 穩(wěn)定性存在問題；轉(zhuǎn)座子片段過大，插入后對受體 菌株帶來負擔(dān)，以及需要構(gòu)建自殺質(zhì)粒作為載體等 問題，近年來進一步發(fā)展了 EZ-Tn5 轉(zhuǎn)座敲除系統(tǒng)
[32] TM

Insertion Kits

�？梢酝ㄟ^體外反應(yīng)，使得 Tn5 轉(zhuǎn)

座酶與線性 DNA 形成聯(lián)合復(fù)合體， 繼而電轉(zhuǎn)化進入 宿主細胞，進行高效的基因隨機插入敲除。線性 DNA 聯(lián)合復(fù)合體的中間部分是抗生素抗性基因，兩 端各含有 19 bp 的反向重復(fù)序列 (ME)， Tn5 轉(zhuǎn)座 是 酶的結(jié)合位點。研究表明，上述轉(zhuǎn)座體系在多種革 蘭氏陰性或陽性細菌中均適用。

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表2

幾種重要工業(yè)微生物中成功應(yīng)用的基因敲除策略

針對這一現(xiàn)象，Hal Alper 等提出了全局轉(zhuǎn)錄機器 工程 (Global transcriptional machinery engineering， gTME) 的新思路[49-51]。以基因轉(zhuǎn)錄機器——RNA 聚 合酶 (RNA polymerase，RNAP) 為對象，可以同時 實現(xiàn)眾多不同基因的轉(zhuǎn)錄抑制、轉(zhuǎn)錄強化以及轉(zhuǎn)錄 不變， 進而在細胞水平上實現(xiàn)目標(biāo)表型的全局優(yōu)化。 2009 年，Wang 等進一步報道了運用多元自動基 因組工程 (Multiplex automated genome engineering， MAGE) 加速進化重組細胞的新方法 [52] 。他們通過 λ-Red β 蛋白輔助重組，在單鏈寡核苷酸中大規(guī)模引 入番茄紅素合成途徑的 24 個目標(biāo)基因的插入和敲 除突變，建立了多元復(fù)合基因突變庫，實現(xiàn)多個目 標(biāo)位點的同時定位、突變。進而通過自動化裝置的 設(shè)計和構(gòu)建，實現(xiàn)了細胞代謝途徑的連續(xù)、自動控 制改造。在 3 d 之內(nèi)，Wang 等就篩選得到了番茄紅 素產(chǎn)量提高 5 倍的重組突變株。 綜上所述，微生物基因敲除技術(shù)是遺傳工程研 究的重大飛躍之一。它為定向改造細菌、放線菌、 酵母菌、霉菌等工業(yè)微生物、培育微生物新品種提 供了重要的技術(shù)支持。隨著后基因組時代的到來以 及各種生物學(xué)實驗方法的日益進步，基因敲除技術(shù) 作為一種強而有力的工具，必將繼續(xù)在生物能源、 生物材料、生物法化學(xué)品以及環(huán)境保護等重要領(lǐng)域 作出重大貢獻。

Table 2 Feasible gene knockout strategies applied in some important industrial microbes
Microbe Bacteria Inheritance Prokaryotes; single-celled; asexual replication only; peptidoglycan cell walls; ribosomes 70S; may contain plasmids Prokaryotes; single-celled; Gram positive; high GC content in DNA; may contain plasmids; spores or mycelium break asexual replication Eukaryotes; single-celled; facultative anaerobic; asexual and sexual replications; ribosomes mainly 80S; polysaccharide cell walls; may contain plasmids Filamentous fungi; heterotrophic eukaryotic; asexual or sexual sprores replication; ribosomes mainly 80S; mycelium forms; not contain plasmids Strategy Homologous recombination [9-21]: Red/ET; linear ssDNA as substrate; RecA dependent/ Chi stimulated; plasmid-based single or double crossover, etc. Transposition [31-32]: Transposon Tn3, Tn5, Tn10, Tn916, etc.; EZ-Tn5 transposome Homologous recombination [27,29,35]: Red/ET; PCR-based linear dsDNA recombination; plasmid based single or double crossover, etc. Transposition [36]: Transposon Tn916; EZ-Tn5 transposome Homologous recombination [37-39]: PCR-based linear dsDNA recombination; plasmid based crossover (positive-negative marker selection) Site-specific recombination [40]: pSR1 plasmid Transposition[41]: Transposon tagging RNAi [42] Homologous recombination [26,43-45 ]: Red/ET; one-step PCR-based gene targeting; linear minimal element (LME); plasmid-based recombination with special genetic tags (positive-negative selection) Transposition [46]: Transposon arrayed gene knockout (TAGKO) RNAi [47] Others [48,26]: Efficient host construction, etc.

Actinobacteria

Yeast

Mold

然而，盡管基因敲除技術(shù)的原理在發(fā)展，應(yīng)用 越來越廣泛，但基因敲除技術(shù)始終存在著一個難以 克服的缺點，即敲掉一個基因并不一定就能獲知該 基因的功能，也不一定能夠顯著改變細胞的代謝途 徑，從而獲得預(yù)期的表型。這是由于，一方面，許 多基因在功能上經(jīng)常是冗余的，敲掉一個在功能上 冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基 因家族的其他成員也可以提供同樣的功能；另一方 面，對于某些必需基因，敲除后又會造成細胞的致 死性， 也就無法對這些必需基因進行相應(yīng)的研究了。 此外， 對于一個目標(biāo)產(chǎn)物合成的代謝途徑， 產(chǎn)物 (或 副產(chǎn)物) 的增多 (或減少) 通常需要眾多基因的協(xié) 同作用，只針對單個基因的敲除研究有時不容易獲 得很好的結(jié)果。
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