本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因楊樹的研究及其生物安全評價，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《東北林業(yè)大學》 2009年

山新楊轉(zhuǎn)Bt+蜘蛛殺蟲肽基因的研究

左麗麗  

【摘要】： 楊樹作為用材、防風、綠化的主要樹種,在我國各省、區(qū)具有廣泛分布和大面積栽培。由于楊樹的病蟲害種類多、危害重,常常給我國的林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)建設造成巨大的經(jīng)濟損失。當前人類的生態(tài)和環(huán)境安全意識日益提高,大量使用化學農(nóng)藥防治病蟲害將受到限制,生物防治的措施又比較薄弱,楊樹有害生物可持續(xù)控制將是森林保護領(lǐng)域面臨的問題。本研究以山新楊為受體,采用農(nóng)桿菌介導法將Bt+蜘蛛殺蟲肽抗蟲基因?qū)朐撌荏w中,不僅為山新楊的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性育種提供了理論基礎(chǔ),同時為山新楊抗蟲品種(系)的擴繁和野外栽培提供了繁殖材料。 1.通過測定不同濃度頭孢對山新楊葉片愈傷組織形成及分化的影響,認為山新楊葉片對頭孢噻肟鈉具有一定的抗性,篩選培養(yǎng)中加入濃度為600mg/L的頭孢霉素不會對山新楊葉片愈傷形成和分化產(chǎn)生不利影響。 2.卡那霉素對山新楊葉片分化和誘導生根所能忍受的臨界濃度為10mg/L,高于該濃度即可抑制山新楊葉片的分化;卡那霉素對山新楊誘導生根所能忍受的臨界濃度為15mg/L,濃度達20mg/L以上時,組培苗的生長明顯受到抑制。 3.在進行山新楊遺傳轉(zhuǎn)化時,預培養(yǎng)時間以2～3d為最好,2d的抗性芽率為23.3%,3d的抗性芽率為20%。預培養(yǎng)時間低于2d和大于4d抗性芽率下降。 4.菌液濃度過高會使受體材料迅速褐化死亡,菌液濃度過低轉(zhuǎn)化抗性芽率低或為零,適宜于山新楊轉(zhuǎn)化的菌液濃度為OD_(600)=0.1～0.2。侵染時間在2～5min有利于山新楊葉片的遺傳轉(zhuǎn)化。在菌液濃度一定時,侵染2～5min抗性芽率隨時間的增加而提高。侵染5min以上時,雖葉片的分化率較高,但是形成的抗性芽較低。 5.共培養(yǎng)時間以2～3d為宜,4d以上不僅假陽性芽增加,而且外植體生長變?nèi)酢⑷~片和芽黃化。 6.優(yōu)化了山新楊遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),預培養(yǎng)2～3d、OD_(600)=0.1～0.2菌液侵染2～5min、共培養(yǎng)2～3d和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加200μmol/LAS為山新楊遺傳轉(zhuǎn)化的最佳組合。 7.共侵染山新楊葉盤1570個,獲得抗性芽植株86個,經(jīng)PCR檢測共獲得21株轉(zhuǎn)基因陽性植株,PCR檢測陽性率達24.42%。PCR-Southern檢測表明有21株顯示出雜交信號,陽性率為100%,轉(zhuǎn)化率為1.34%。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：S792.11
【目錄】：

摘要3-4

Abstract4-8

1 緒論8-19

1.1 課題背景(或引言)8

1.2 楊樹轉(zhuǎn)基因研究概況8-17

1.2.1 楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因研究進展9-15

1.2.2 楊樹基因工程遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)15-17

1.3 山新楊概況17

1.4 研究目的和意義17-19

2 材料與方法19-37

2.1 材料19-21

2.1.1 植物材料與植物培養(yǎng)基19

2.1.2 菌株與質(zhì)粒19-20

2.1.3 主要儀器和設備20

2.1.4 主要試驗藥品20

2.1.5 抗生素20-21

2.1.6 常用溶液的配制方法21

2.2 試驗方法21-35

2.2.1 主要的技術(shù)路線21-22

2.2.2 山新楊組培苗的繼代培養(yǎng)22-23

2.2.3 抗生素敏感性測定23-24

2.2.4 農(nóng)桿菌介導抗蟲基因轉(zhuǎn)化24-26

2.2.5 影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素26-27

2.2.6 轉(zhuǎn)基因山新楊的PCR檢測及PCR-Southern鑒定27-30

2.2.7 轉(zhuǎn)基因植株的PCR-Southern檢測30-35

2.3 本章小結(jié)35-37

3 結(jié)果與分析37-47

3.1 抗生素敏感性測定37-39

3.1.1 卡那霉素濃度對山新楊葉片分化的影響37

3.1.2 頭孢噻肟鈉濃度與山新楊葉片分化的關(guān)系37-38

3.1.3 卡那霉素濃度與山新楊莖段生根的關(guān)系38

3.1.4 頭孢噻肟鈉濃度與農(nóng)桿菌生長的關(guān)系38-39

3.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率與各因素的關(guān)系39-42

3.2.1 預培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的關(guān)系39-40

3.2.2 最佳菌液濃度測定40

3.2.3 侵染時間測定40-41

3.2.4 共培養(yǎng)時間與轉(zhuǎn)化效率的關(guān)系41-42

3.2.5 乙酰丁香酮(AS)對轉(zhuǎn)化效率的影響42

3.3 轉(zhuǎn)基因山新楊分子檢測42-45

3.3.1 山新楊DNA提取42

3.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測42-43

3.3.3 PCR-Southern檢測43-45

3.4 本章小結(jié)45-47

結(jié)論與討論47-49

參考文獻49-54

附錄54-58

攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文58-59

致謝59-60

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7 林士杰;檉柳冷適應蛋白（CAP）基因的功能驗證[D];東北林業(yè)大學;2007年

8 王雷;轉(zhuǎn)耐鹽相關(guān)基因山新楊的抗逆性分析[D];東北林業(yè)大學;2009年

9 裴勇強;化學生態(tài)及無公害調(diào)控青楊天牛種群的基礎(chǔ)研究[D];東北林業(yè)大學;2010年

10 謝興;楊樹枝條酚酸的提取與分析及其對青楊天牛的影響[D];東北林業(yè)大學;2010年

相關(guān)機構(gòu)

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>西北農(nóng)林科技大學

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