本文關鍵詞：利用Tol2轉座子構建斑馬魚心臟組織特異表達轉基因載體及其表達分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

當前位置：首頁 >> 生物學 >> 利用Tol2轉座子構建斑馬魚心臟組織特異表達轉基因載體及其表達分析

生物工程學報
journals.im.ac.cn cjb@im.ac.cn

Chin J Biotech 2010, February 25; 26(2): 230?236 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 ?2010 CJB, All rights reserved.
生物技術與方法

利用 Tol2 轉座子構建斑馬魚心臟組織特異表達轉基因 載體及其表達分析
陳婷芳，羅娜，謝華平，吳秀山，鄧云
湖南師范大學生命科學學院 心臟發(fā)育研究中心，長沙 410081

摘

要: 為了制備用于在斑馬魚心臟中特異表達目的基因的轉基因載體，通過分子克隆的方法對能夠在斑馬魚心臟中

特異表達 EGFP 報告基因的 Tol2 載體進行了改造，在原有的 CMLC2 啟動子與 EGFP 編碼區(qū)之間插入帶有多克隆位點 的 IRES 序列，獲得 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 轉基因表達載體，該載體可以實現(xiàn)在同一個啟動子 CMLC2 的驅動下分 別同時表達目的基因和 EGFP；為了驗 證該表達載體 的有效性，進 一步在 CMLC2 啟動子與 IRES 序列之 間插入 DsRed-Monome 編碼區(qū)， 利用得到的 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 轉基因載體顯微注射到斑馬魚單細胞期胚胎中進行 表達分析，結果表明外源目的基因 DsRed-Monome 和報告基因 EGFP 均能以相同的表達模式在斑馬魚心臟組織中特異 表達。pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 轉基因表達載體的成功構建對于建立心臟發(fā)育候選基因的斑馬魚轉基因實驗模型具有 重要意義。 關 鍵 詞 : Tol2 轉 座 子 ， 斑 馬 魚 ， 轉 基 因 ， 心 臟 特 異 表 達

Construction and expression analysis of the zebrafish heart-specific transgenetic vector based on Tol2 transposable element
Tingfang Chen, Na Luo, Huaping Xie, Xiushan Wu, and Yun Deng
College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China

Abstract: In an effort to generate a desired expression construct for making heart-specific expression transgenic zebrafish, a Tol2
plasmid, which can drive EGFP reporter gene specifically expressed in the heart, was modified using subcloning technology. An IRES fragment bearing multiple cloning site (MCS) was amplified directly from pIRES2-EGFP plasmid and was inserted between the CMLC2 promoter and EGFP fragment of the pDestTol2CG vector. This recombinant expression plasmid pTol2-CMLC2-IRES-EGFP can drive any interested gene specifically expressed in the zebrafish heart along with EGFP reporter gene. To test the effectiveness of this new expression plasmid, we constructed pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP plasmid by inserting another reporter gene DsRed-Monome into MCS downstream of the CMLC2 promoter and injected this transgenic recombinant plasmid into one-cell stage embryos of zebrafish. Under fluorescence microscope, both the red fluorescence and the green

Received: August 14, 2009; Accepted: December 16, 2009 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30671137), Postgraduate Scientific Innovation Fund of Hunan Province (No. CX2009B108). Corresponding author: Yun Deng. Tel: +86-731-88872780; Fax: +86-731-88615078; E-mail: dengyun2008@yahoo.com.cn 國家自然科學基金 (No. 30671137)，湖南省研究生科研創(chuàng)新項目 (No. CX2009B108) 資助。

陳婷芳等: 利用 Tol2 轉座子構建斑馬魚心臟組織特異表達轉基因載體及其表達分析

231

fluorescence produced by pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP were detected specifically in the heart tissue in the same expression pattern. This novel expression construct pTol2-CMLC2-IRES-EGFP will become an important tool for our research on identifying heart development candidate genes’ function using zebrafish as a model. Keywords: Tol2 transposon, zebrafish, transgenesis, heart-specific expression

轉座子作為插入突變源和分子標簽被廣泛應用 于基因的分離、克隆以及基因功能分析，利用基因 的轉座原理可研究基因的調控模式，可為脊椎動物 細胞的分化和發(fā)育提供依據 [1]。Tol2 是近年發(fā)現(xiàn)的 唯一的天然存在且具有轉座活性的脊椎動物轉座 子，存在于中國、韓國、日本等國的一種淡水魚—— 青鳉 Oryzias latipes 的基因組中 。Kawakami 等利 用 Tol2 轉座子構建了含有特異性啟動子調節(jié)基因表 達的序列 (SIX3.2:gfp) 載體，該質粒 DNA 和體外 合成的相應轉座酶基因 mRNA 共注射到單細胞期 斑馬魚胚胎中。插入基因組的轉座子序列能高頻率 傳遞 F1 斑馬魚，其中特異性啟動子調節(jié)基因表達 的序列 (SIX3.2:gfp) 可以穩(wěn)定存在于轉基因魚 。 Tol2 轉座子系統(tǒng)在脊椎動物的基因克隆和基因功能 分析方面具有重要的應用前景，對分子生物學的發(fā) 展有著深遠的意義。但是，目前還沒有適合斑馬魚 心臟組織特異性表達外源目的基因的 Tol2 轉座子轉 基因載體。 Kwan 等將 Tol2 轉座子中轉座酶編碼基因切除， 代之以 CMLC2-EGFP-polyA 表達序列和其他重組 篩選序列， CCDB (Control of cell death) 基因序列 如 等，構建了 pDestTol2CG2 質粒，將該質粒與轉座酶 mRNA 一起顯微注射斑馬魚單細胞期胚胎，觀察到 斑馬魚心臟組織中有綠色熒光蛋白特異表達，同時 外源片段整合效率高 。但是直接將 pDestTol2CG2 質粒用于心臟發(fā)育候選基因的斑馬魚轉基因載體還 有許多缺陷。首先，CMLC2 啟動子下游沒有可供選 擇的多克隆位點以便插入一個心臟發(fā)育候選基因編 碼序列；其次，如果將 EGFP 編碼基因切除，代之 以其他心臟發(fā)育候選基因編碼序列，失去報告基因 ——綠色熒光蛋白的表達對分析目的基因的表達非 常不方便；第三，如果將心臟發(fā)育候選基因編碼序 列與 EGFP 編碼基因直接連接， CMLC2 啟動子驅 在 動下兩個蛋白融合表達，目的基因蛋白的生物活性
[4] [3] [2]

可能受到影響。 為了構建適用于在斑馬魚心臟中特異表達目的 基因的轉基因載體，本實驗利用分子克隆的方法對 能夠在斑馬魚心臟中特異表達 EGFP 報告基因的 Tol2 轉座子載體進行了改造， 在原有的 CMLC2 啟動 子與 EGFP 編碼區(qū)之間插入帶有多克隆位點的 IRES 序列， 獲得 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 轉基因表達載 體， 該載體可以實現(xiàn)在同一個啟動子 CMLC2 的驅動 下分別同時表達目的基因和 EGFP； 為了驗證該表達 載體的有效性，在 CMLC2 啟動子與 IRES 序列之間 插入 DsRed-Monomer 編碼區(qū)，將得到的表達外源基 因 DsRed-Monomer 的 重 組 載 體 pTol2CMLC2-RED-IRES-EGFP 顯微注射到斑馬魚單細胞 期胚胎中進行表達分析：外源目的基因 (DsRed-Monomer) 和 報 告 基 因 (EGFP) 均 能 以 相 同 的 模 式 在 斑 馬 魚 心 臟 組 織 中 特 異 表 達 。 pTol2CMLC2-IRES-EGFP 轉基因表達載體的成功構建為 以斑馬魚作為動物模型，研究人類心臟發(fā)育候選基 因在心臟發(fā)育中的功能奠定了重要基礎。

1 材料與方法
1.1 材料
pDestTol2CG2 等質 粒為日本國 立遺傳研究所 Kawakami 教 授 惠 贈 ， Tol2 轉 座 子 中 含 有 CCDB (Control of cell death) 基因和 CMLC2-EGFP-polyA 表達序列，其詳細的載體結構圖見 Kawakami 教授實 驗室 網站 php/PDestTol2CG 。 pDsRed-Monomer-C1 、 pIRES2EGFP 質粒以及大腸桿菌 DH5α 菌株為湖南師范大 學心臟發(fā)育研究中心保存。凝膠回收試劑盒、DNA 連接試劑盒、DNA 補平試劑盒、LA Taq DNA 聚合 酶和各種限制性內切酶為 TaKaRa 公司產品。大腸 桿菌 One Shot ccdB Survival Competent Cells 購自 Invitrogen 公司，–80℃保存。條紋斑馬魚品系購自
Journals.im.ac.cn

232

ISSN1000-3061

CN11-1998/Q

Chin J Biotech

February 25, 2010

Vol.26

No.2

中國科學院武漢水生生物研究所，28℃自動水循環(huán) 魚缸培養(yǎng)。

以 pIRES2-EGFP 質粒 DNA 為模板，以 IRES-F3 (5'?3')：TCCATGGTTCGAATTCTGCAGTCGACGG (下劃線部分為 Nco I 酶切位點)和 IRES-R3 (5'?3')： GGTCATGATTGTGGCCATATTATCATCG ( 下 劃 線 部分為 BspHⅠ酶切位點)為引物，利用 LA Taq PCR 擴增帶有 EcoR I、 I、 Sal BamH I 等克隆位點的 IRES 序列，克隆到 pUM18-T 質粒上，酶切、測序鑒定獲 得 pUM18-T/IRES 質粒。然后用 Nco I/BspH I 雙酶 切 pUM18-T/IRES 質粒， 回收 IRES 目的片段克隆至 pTol2-CMLC2-EGFP 質粒中 CMLC2 啟動子下游的 Nco I 位點。經酶切、測序鑒定獲得 pTol2-CMLC2IRES-EGFP 表達質粒。

1.2

pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 多克隆位點表達
pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 多 克 隆 位 點 表 達 載

載體的構建
體及其下游表達載體的構建流程見圖 1。 pDestTol2CG2 轉化入大腸桿菌 One Shot ccdB Survival Competent Cells，氨卞青霉素篩選，混收菌 落，提取質粒后用限制性內切酶 SalⅠ和 KpnⅠ切除 pDestTol2CG2 質粒中的 CCDB 片段，回收骨架目的 片段后用 DNA 補平試劑盒補平后連接環(huán)化， 轉化大 腸桿菌 DH5α，純化得到 pTol2-CMLC2-EGFP 質粒。

圖1

斑馬魚心臟組織特異表達轉基因載體的構建

Fig. 1 Construction of the zebrafish heart-specific transgenetic vector.
Journals.im.ac.cn

陳婷芳等: 利用 Tol2 轉座子構建斑馬魚心臟組織特異表達轉基因載體及其表達分析

233

1.3

pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 表達載體的

限制性內切酶 Sal I 和 Kpn I 切除其中的 CCDB 片段， 回收骨架目的片段用 DNA 補平試劑盒補平后連接 環(huán)化 ； 限制 性內 切 酶 Sal I 的 酶 切 位點 在 得到 的 pTol2-CMLC2-EGFP 質粒中并未消失，該位點位于 poly A 序列的下游。將帶有 EcoR I、Sal I、BamH I 等克隆位點的 IRES 序列正確連接到 pTol2-CMLC2EGFP 質 粒 的 Nco I 位 點 ， 得 到 pTol2-CMLC2IRES-EGFP 重組質粒。本實驗共制備了 6 個重組質 粒 DNA，經 Sal I 酶切后電泳結果見圖 2，有 5 個質 粒 酶 切 片 段 的 大 小 與 預 期 大 小 一 致 (5044 bp 和 1779 bp)。結果表明，帶有 EcoR I、Sal I、BamH I 等 克 隆 位 點 的 IRES 序 列 已 成 功 地 克 隆 到 pTol2-CMLC2-EGFP 質粒中，該結果經進一步的測 序分析得到證實。

構建 根據紅色熒光蛋白的表達序列，設計 PCR 擴增
引物 DSRED-F(5'?3')：GCCATGGACAACACCGAG GACGTC ( 下 劃 線 部 分 為 Nco I 酶 切 位 點 ) 和 DSRED-R (5'?3')： GGAATTCTTACTACTGGGAGCC GGAGTGG (下劃線部分為 EcoR I 酶切位點)。利用 引物 DSRED-F/DSRED-R，以 pDsRed-Monomer-C1 質粒 DNA 為模板， 通過 PCR 擴增出 DsRed-Monomer 編碼序列的 DNA 片段，克隆到 pUC18-T 質粒上，經 酶切， 測序鑒定得到 pUC18-T/DsRed- Monomer 質粒。 Nco I/EcoR I 雙酶切 pUC18-T/DsRed-Monomer 質 粒后， 將回收到的 DsRed-Monomer 編碼序列的 DNA 片段克隆到 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 多克隆位點 表達質粒中。經 PCR、測序鑒定獲得 pTol2-CMLC2RED-IRES-EGFP 表達質粒。

2.2

pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 表達載體的

1.4

斑馬魚心臟特異表達轉基因載體的表達分析
斑馬魚受精卵的獲�。菏芫皩⒋菩塾H魚分開

鑒定 用 引 物 DSRED-F/DSRED-R 從 質 粒 pDsRedMonomer-C1 克隆到 DsRed-Monomer 編碼序列的 DNA 片 段 ， 經 測 序 鑒 定 后 連 接 到 pTol2-CMLC2IRES-EGFP 表達質粒的 Nco I/ EcoR I 位點，獲得 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 表達質粒。 Nco I/ 用 EcoR I 雙酶切的方法鑒定獲得 pTol2-CMLC2-REDIRES-EGFP 表達質粒，用 0.8％瓊脂糖凝膠電泳分 析雙酶切產物， 結果如圖 3 所示。 質粒雙酶切后 DNA 片段的大小與預期的 DsRed-Monomer 編碼序列片段 (687 bp) 和表達載體片段 (6823 bp) 的大小一致。 結 果 表 明 ， 已 成 功 地 構 建 了 pTol2-CMLC2-REDIRES-EGFP 表達載體，也進一步證實了測序結果。

飼喂 2~3 d 后按 1:1~2 比例放入產卵池中進行產卵受 精。分選和洗凈的卵移到有瓊脂糖的表面皿中，注 射外源 DNA 濃度為 0.15 ?g/?L， DNA 體積約 2 nL。 受精卵的動物極注射完畢后，慢慢抽出注射針，將 受精卵放入裝有無菌水的培養(yǎng)皿中， 使其恢復發(fā)育； 25℃~28℃培養(yǎng)胚胎，分別在 24 h、48 h、72 h 后， 熒光顯微鏡下觀察篩選心臟組織具有熒光蛋白的胚 胎個體。有綠色熒光的個體表示成功載入報告基因 EGFP 的嵌合個體。

2 結果與分析
2.1 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 多克隆位點表達
pDestTol2CG2 質粒是把 Tol2 轉座子中轉座酶切 除后， CCDB (Control of cell death) 基因和 CMLC2將 EGFP-polyA 表達序列并入到 Tol2 轉座子中，其中 CCDB 基因的上游和下游均帶有同源重組臂。如果 沒有外源 DNA 片段同源重組置換 CCDB 片段， CCDB 基 因 則 會 表 達 蛋 白 ， 會 破 壞 細 菌 的 DNA gyrase，造成細菌染色體的降解導致細菌死亡，因此 不能轉入 DH5α 中進行擴增。pDestTol2CG2 質粒經
圖2 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP質粒的酶切鑒定

載體的鑒定

Fig. 2 Identification of pTol2-CMLC2-IRES-EGFP plasmid by enzyme digestion. M: DNA marker; 1–6: agarose electrophoresis of the six different pTol2-CMLC2- IRES-EGFP plasmids digested with Sal I. 1, 2, 3, 4 and 6 are the positive plasmids.
Journals.im.ac.cn

234

ISSN1000-3061

CN11-1998/Q

Chin J Biotech

February 25, 2010

Vol.26

No.2

A

B

圖4 圖3 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 質 粒 的 Nco I 和 EcoR I雙酶切鑒定
Fig. 3 Identification of pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP plasmids by enzyme digestion with Nco I and EcoR I. M: DNA marker; 1, 2: agarose electrophoresis of the two different pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP plasmids digested with Nco I and EcoR I. 1 and 2 are both the positive plasmids.

綠色熒光蛋白在斑馬魚心臟組織中的表達分析

Fig. 4 EGFP protein was specifically expressed in the heart tissue of the zebrafish embryos microinjected with pTol2-CMLC2-IRES-EGFP. Lateral (A) and ventral (B) side observation was performed with Nikon fluorescence microscope, and green fluorescence was detected in the heart of the zebrafish embryos using green light excitated. Ventricle marked by red arrow and atria marked by white arrow.
A B C

2.3

斑馬魚心臟特異表達轉基因載體的表達分析
將 目 的 基 因 序 列 連 接 到 pTol2-CMLC2-

IRES-EGFP 質粒的多克隆位點 (MCS)， 得到目的基 因的表達載體；該載體在 CMLC2 啟動子作用下，可 以在心臟組織中特異轉錄目的基因的 mRNA； 該 mRNA 實際上也包括 IRES 轉錄序列和報告基因 EGFP 轉錄序列。因此，該 mRNA 能在細胞中翻譯 成目的蛋白和綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白在心臟 組織中的表達時空模式可以間接地反映外源目的蛋 白的時空表達模式。 為了分析 IRES 序列或克隆位點 插入的目的基因對綠色熒光蛋白表達的影響， pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 和 pTol2-CMLC2-REDIRES-EGFP 表達質粒純化后顯微注射到斑馬魚單細 胞期胚胎，在 24 h 后，在熒光顯微鏡下可以觀察到 綠 色 熒 光 蛋 白 在 顯 微 注 射 了 pTol2-CMLC2-IRESEGFP 表達質粒的斑馬魚胚胎心臟組織中特異表達 (圖 4)。 顯微注射 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 表 達質粒的斑馬魚胚胎心臟組織中既有紅色熒光蛋白 又有綠色熒光蛋白特異表達，且綠色熒光蛋白的時 空表達模式與紅色熒光蛋白相同；綠色熒光的熒光 強度比紅色熒光弱 (圖 5)。
圖 5 分析
Fig. 5 EGFP protein and RED protein were specifically and coinstantaneously expressed in the heart tissue of the zebrafish embryos microinjected with pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP. Observation of fluorescence of the heart tissue of the zebrafish embryos microinjected with pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP was performed with a Nikon fluorescence microscope. The green fluorescence (B) and red fluorescence (C) was displayed specifically and coinstantaneously in the heart tissue of the zebrafish embryos (A) microinjected and excited by blue light and red light respectively. Ventricle marked by red arrow and atria marked by white arrow.

綠色和紅色熒光蛋白在斑馬魚心臟組織中的表達

注射轉座元件的青鳉交配，后代中有約 1/5 的基因 組中帶有 GFP 基因， 表明 GFP 基因在當代通過 Tol2 的轉座整合到基因組中了。已經有研究表明，Tol2 可攜帶長達 9.7 kb 的外源標記基因，整合到受體基 因組的染色體上 [6]。 Kwan 將 Tol2 轉座子中轉座酶編碼基因切除， 代 之 以 CMLC2-EGFP-polyA 表 達 序 列 ， 構 建 了 pDestTol2CG2 質粒，將該質粒與轉座酶 mRNA 一 起顯微注射斑馬魚單細胞期胚胎，觀察到斑馬魚心 臟組織中有綠色熒光蛋白特異表達，同時外源片段 整合效率高 [4]。 正如上述所言， 直接將 pDestTol2CG2 質粒用于心臟發(fā)育候選基因的斑馬魚轉基因載體還 有許多缺陷。內部核糖體進入位點 (IRES) 序列來

3 討論
Koga 等 [5]將 Tol2 轉座子中 119 kb 的轉座酶編碼 基因切除，代之以 GFP 基因，將改造后的片段與轉 座酶 mRNA 一起顯微注射到基因組不含 Tol2 轉座元 件的菲律賓青鳉受精卵中。將存活的成年青鳉與未
Journals.im.ac.cn

陳婷芳等: 利用 Tol2 轉座子構建斑馬魚心臟組織特異表達轉基因載體及其表達分析

235

源于腦心肌炎病毒 [7]，它可翻譯一條 mRNA 上的兩 個開放閱讀框，由其連接的兩個基因的表達效率相 同
[8-9]

達，綠色熒光蛋白表達時空模式可以間接地反映 RED 基因的表達時空模式。 根據已有的文獻報道共注射編碼轉座酶 mRNA 整合率高達 50％ [3]，在向單細胞期斑馬魚胚胎中注 射實驗中，本實驗曾嘗試表達質粒與轉座酶 mRNA 共注射和表達質粒單獨注射兩種方法，結果表明： 表達質粒與轉座酶 mRNA 共注射和表達質粒單獨注 射均能觀察到紅色熒光和綠色熒光在斑馬魚心臟組 織中特異表達，并且兩者的時空模式相同(圖 4)；且 有無轉座酶 mRNA 的顯微注射，陽性個體之間紅色 熒光和綠色熒光在心臟組織中分布和均一性等均有 不同程度的差異，并未發(fā)現(xiàn)共注射陽性個體的均一 性明顯優(yōu)于單獨注射陽性個體；只是共注射編碼轉 座酶 mRNA 的斑馬魚胚胎表達紅色熒光和綠色熒光 的陽性率高達 18％， 單獨注射 Tol2 轉座子重組表達 載體只有 3％~6％，但表達陽性率的高低并不影響 轉基因表達載體的定性分析 [12]。 本實驗構建的 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 的斑 馬魚轉基因表達載體引入一個多克隆位點片段，能 方便插入一個心臟發(fā)育候選基因；與轉座酶 mRNA 一起顯微注射斑馬魚單細胞期胚胎，Tol2 轉座子整 合效率高可以實現(xiàn)心臟發(fā)育候選基因表達序列的高 效整合， 通過熒光顯微鏡觀測報告基因 EGFP 有無表 達，即能準確分析目的基因的表達情況，且方法簡單 易行。因此，該載體的成功構建對于建立心臟發(fā)育 候選基因的斑馬魚轉基因實驗模型具有重要意義。

。 本實驗切除了 pDestTol2CG2 質粒中的 CCDB

片段， 同時將帶有多克隆位點的 IRES 片段克隆到質 粒中 CMLC2 啟動子下游的 Nco I 位點。改造后的表 達質粒 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 在斑馬魚心臟組 織中有綠色熒光蛋白特異表達 (圖 4)；同時，綠色 熒光在心房和心室中表達的強度有差異，心室熒光 信號很強，而心房的熒光信號很弱；該結果與其他 文獻報道的結果一致 ，這種情況可能是與 CMLC2 啟動子特性有關
[10] [4]

。因此，插入 IRES 片段后對綠

色熒光蛋白特異表達沒有影響。 根據基因工程原理將目的基因和報告基因 (如 EGFP) 通過 IRES 序列連接起來，兩個基因在同一 個啟動子作用下轉錄成單鏈 mRNA，但翻譯時又是 相互獨立的，不會形成嵌合蛋白 [8-9]，保證了目的基 因蛋白的生物活性，并且理論上只要有報告基因 (如 EGFP) 的表達，目的基因也肯定會表達，因此 便于通過檢測報告基因 EGFP 的表達來進行轉基因 生物個體的篩選
[11]

。對于 pTol2-CMLC2-RED-IRES-

EGFP 表達質粒來說，在 CMLC2 啟動子作用下，在 心臟組織中特異轉錄目的基因 DsRed-Monomer 的 mRNA 實際上也包括 IRES 轉錄序列和報告基因 EGFP 轉錄序列。該 mRNA 能在細胞中翻譯出目的 蛋白——紅色熒光蛋白和報告基因蛋白——綠色熒 光蛋白；EGFP 蛋白與 DsRed-Monomer 蛋白的編碼 框是獨立的，均有各自的起始位點 ATG 和終止位點 TGA 或 TAA 等，核糖體與該 mRNA 的 5′端前導序 列結合翻譯成目的蛋白——紅色熒光蛋白后脫離， 同時，核糖體也可以與該 mRNA 的 IRES 序列結合 翻譯下游的綠色熒光蛋白。因此，在細胞中紅色熒 光蛋白和綠色熒光蛋白是兩個獨立蛋白，而不是融 合蛋白。同時，只要有綠色熒光蛋白的表達就可以 證明 IRES 在斑馬魚胚胎中的有效性。 將質粒純化后 顯微注射到斑馬魚單細胞期胚胎，24 h 后，在熒光 顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎心臟組織中紅色熒光蛋白 和綠色熒光蛋白均同時特異表達，，綠色熒光的熒光 強度比紅色熒光弱 (圖 5)。因此，在 CMLC2 啟動子 的驅動下，與 IRES 序列相連接的雙基因可同時表

REFERENCES
[1] Ni J, Clark KJ, Fahrenkrug SC, et al. Transposon tools hopping in vertebrates. Brief Funct Genomic Proteomic, 2008, 7(6): 444–453. [2] Inagaki H, Koga A, Bessho Y, et al. The tyrosinase gene from medakafish: transgenic expression rescues albino mutation. Pigment Cell Res, 1998, 11(5): 283–290. [3] Kawakami K, Takeda H, Kawakami N, et al. A transposon-mediated 2004, 7(1): 133–144. [4] Kwan KM, Fujimoto E, Grabher C, et al. The Tol2 kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn, 2007,
Journals.im.ac.cn

gene

trap

approach

identifies

developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell,

236

ISSN1000-3061

CN11-1998/Q

Chin J Biotech

February 25, 2010

Vol.26

No.2

236(11): 3088–3099 [5] Koga A, Hori H, Sakaizumi M. Gene transfer and cloning of flanking chromosomal regions using the medaka fish Tol2 transposable element. Mar Biotechnol (NY), 2002, 4(1): 6–11. [6] Yant SR, Meuse L, Chiu W, et al. Somatic integration and longterm transgene expression in normal and haemophilic mice using a DNA transposon system. Nat Genet, 2000, 25(1): 35–41. [7] Martínez-Salas E. Internal ribosome entry site biology and its use in expression vectors. Curr Opin Biotechnol, 1999, 10(5): 458–464. [8] Hennecke M, Kwissa M, Metzger K, et al. Composition and arrangement of genes define the strength of IRES driven translation in bicistronic mRNAs. Nucleic Acids Res, 2001, 29(16): 3327–3334.

[9] Li T, Zhang J. Stable expression of three genes from a tricistronic retroviral vector containing a picornavirus and 9-nt cellular internal ribosome entry site elements. J Virol Methods, 2004, 115(2): 137–144. [10] Huang CJ, Tu CT, Hsiao CD, et al. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn, 2003, 228(1): 30–40. [11] Xiao T, Roeser T, Staub W, et al. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development, 2005, 132: 2955–2967. [12] Fisher S, Grice EA, Vinton RM, et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc, 2006, 1: 1297–1305.

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

科學出版社科學出版中心生命科學分社新書推介
植物光合、蒸騰與水分利用的生理生態(tài)學
于貴瑞 王秋鳳 等著 978-7-03-026045-1 ￥128.00 2010 年 1 月 出版 本書以氣孔行為控制的植物光合、蒸騰和水分利用為主線, 系統(tǒng)地論述了植物光 合、蒸騰和水分利用的生理生態(tài)學基礎, 介紹了生態(tài)系統(tǒng)的光合、蒸騰和水分利用效率 變化特征及其模型模擬的基礎知識和主要的研究進展。本書在論述生物圈與其他圈層 間關系的基礎上, 著重論述了植物的氣孔行為及氣孔導度的模擬模型, 植物光合作用 及其模擬方法, 植物蒸騰及其模擬方法, 植物的水分利用及其模擬模型, 以及基于植 物光合、蒸騰和水分利用相互作用關系的生態(tài)系統(tǒng)碳、水和能量平衡綜合模型。 本書是作者研究團隊多年科研工作的總結, 歸納分析了國內外本研究領域的重要 進展, 其目的是為國內從事相關領域研究的科技人員提供關于植物光合、 蒸騰和水分利 用效率方面的參考資料,本書也可作為相關領域的研究生基礎教材。

歡迎各界人士郵購科學出版社各類圖書（免郵費） 郵購地址：北京東黃城根北街 16 號 網上訂購： 科學出版社 科學出版中心 生命科學分社 郵編： 100717 聯(lián)系人：李韶文（010-64000849） 周文宇（010-64031535） www.amazon.cn 更多精彩圖書請登陸網站 ，歡迎致電索要書目

Journals.im.ac.cn



  本文關鍵詞：利用Tol2轉座子構建斑馬魚心臟組織特異表達轉基因載體及其表達分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。