本文關鍵詞：果樹轉基因研究進展與產業(yè)化展望，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《湖南農業(yè)大學》 2009年

豆梨遺傳轉化體系的建立及轉基因植株增殖生根研究

劉松瑜  

【摘要】： 豆梨是南方梨樹常用砧木,耐瘠薄,對土壤的適應性強,抗旱,耐澇,抗腐爛病,跟西洋梨和中國梨的親和性都很好,但不耐寒,苗期根系稀少,生長較弱。rolB基因是從Agrobacteciumrhizogenes菌的Ri質粒的T-DNA上分離出來的,rolB基因能夠使植株矮化和明顯的改善生根。將rolB基因轉入砧木植株中,可使砧木矮化,增強生根能力。 本研究以南方梨砧木豆梨的子葉作為轉基因的受體材料,以rolB基因為外源基因,研究了不同預培養(yǎng)時間、工程菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間以及篩選方法對其遺傳轉化效率的影響及適合轉基因豆梨的增殖與生根培養(yǎng)基。以MS+NAA0.2mg/L+6-BA4mg/L為分化培養(yǎng)基,在此基礎上進行了豆梨的遺傳轉化研究,通過豆梨子葉的敏感性試驗,最終確定子葉誘導愈傷組織和不定芽時Kan的臨界濃度為50mg/L,芽誘導生根時Kan的臨界濃度為25mg/L,抑菌抗生素Cef和Carb保持在250mg/L時既能起到抑菌作用,又能保證有一定再生率。成功摸索出農桿菌介導的豆梨遺傳轉化體系：將豆梨子葉預培養(yǎng)4d,菌液濃度OD_(600)=0.4,添加100μM/L的AS,侵染10min,共培養(yǎng)3d,預培養(yǎng)和共培養(yǎng)都在暗處25℃進行,共培養(yǎng)后依次加入25mg/LKan到50mg/LKan的量篩選或共培養(yǎng)后晚6d再加入50mg/LKan的量進行篩選。通過農桿菌介導法將外源rolB基因導入到豆梨中,為豆梨的遺傳轉化及抗性育種提供理論基礎。 其中一部分抗性苗在添加Kan的篩選培養(yǎng)基上的再生,并通過PCR分子檢測,有4株出現了特異性擴增條帶,而陰性對照沒有特異性條帶產生,說明外源基因已經初步整合到豆梨基因組中。豆梨子葉的遺傳轉化中最高不定芽分化率達到15%。 通過對豆梨轉化苗的增殖試驗,表明轉化苗繼代增殖時以MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+Kan25mg/L+Carb 180mg/L+Cef180mg/L為培養(yǎng)基。通過對轉化苗豆梨的生根試驗,表明轉化植株在生根能力上明顯強于對照,在以1/4MS+IBA3.0mg/L為生根培養(yǎng)基時,生根率為80%,而對照只有60%,轉化植株表現為須根增多。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：湖南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：S661.2
【目錄】：

摘要8-9

Abstract9-11

第一章 前言11-22

1 農桿菌介導的梨轉基因研究進展11-17

1.1 農桿菌介導法的研究進展11-15

1.2 農桿菌介導法在果樹中的應用15-16

1.3 農桿菌介導法在梨中的應用16-17

1.4 梨轉化中存在的問題17

2 rol基因性狀研究17-18

2.1 rolB基因對生根影響研究17-18

2.2 rol基因矮化性狀研究18

3 國內外梨矮化砧木的研究現狀18-19

4 本試驗的目的19-21

5 主要技術路線21-22

第二章 豆梨農桿菌遺傳轉化體系的建立22-41

1 材料與方法22-26

1.1 根癌農桿菌菌株及質粒22

1.2 植物材料22

1.3 遺傳轉化基本培養(yǎng)基22-23

1.4 植物生長物質23

1.5 細菌培養(yǎng)基23

1.6 抗生素23-24

1.7 試驗方法24-26

2 結果與分析26-37

2.1 子葉對Kan的敏感性分析26-27

2.2 子葉對Cef和Carb的敏感性分析27-28

2.3 Kan對植株生根的影響28-29

2.4 Cef和Carb對植株生根的影響29-30

2.5 農桿菌介導的rolB基因轉化30-36

2.5.1 預培養(yǎng)時間對轉化的影響30-31

2.5.2 As的濃度對轉化的影響31-32

2.5.3 菌液的濃度對轉化的影響32-33

2.5.4 侵染時間對轉化的影響33-34

2.5.5 共培養(yǎng)時間對子葉分化和轉化的影響34

2.5.6 篩選方式對轉化的影響34-36

2.6 抗性植株的獲得36

2.7 抗性植株的葉片再生36-37

3 討論與小結37-41

3.1 討論37-40

3.1.1 影響豆梨農桿菌轉化效率的因素37-40

3.1.2 豆梨轉化植株的篩選40

3.2 小結40-41

第三章 轉rolB基因豆梨分子檢測及芽增殖生根研究41-48

1 材料與方法41-44

1.1 材料41

1.2 試驗方法41-44

1.2.1 基因組DNA提取方法41

1.2.2 基因組DNA提取步驟41-42

1.2.3 PCR分子檢測42-43

1.2.4 增殖生根培養(yǎng)基43

1.2.5 增殖生根培養(yǎng)方法43-44

2 結果與分析44-46

2.1 PCR的檢測結果44

2.2 芽的增殖44-45

2.2.1 植物生長調節(jié)劑對芽增殖的影響44-45

2.2.2 轉基因與對照芽增殖的差別45

2.3 生根培養(yǎng)45-46

2.3.1 不同培養(yǎng)基配方對豆梨生根的影響45-46

2.3.2 轉基因豆梨與對照生根差異46

3 討論與小結46-48

3.1 討論46-47

3.2 小結47-48

全文總結及下步工作設想48-50

縮略詞表50-51

圖版及說明51-54

參考文獻54-59

致謝59-60

個人簡歷60

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