本文關(guān)鍵詞：母豬初情期啟動(dòng)相關(guān)基因TAC3的表達(dá)調(diào)控研究　出處：《華南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：神經(jīng)激肽B(NeurokininB,NKB)屬于速激肽家族成員,由速激肽3基因(Tachykinin3,TAC3)編碼,NKB在初情期啟動(dòng)前與Kisspeptin、Dynorphin A協(xié)同作用誘導(dǎo)初情期的啟動(dòng)。母豬初情期是指母豬第一次發(fā)情并排卵的過(guò)程,標(biāo)志著母豬具有繁殖能力。研究表明,NKB與其受體NK3R(Neurokinin B receptor 3)結(jié)合促進(jìn)GnRH的釋放進(jìn)而誘導(dǎo)動(dòng)物初情期的啟動(dòng)。當(dāng)NKB或者其受體NK3R發(fā)生突變時(shí)導(dǎo)致低促性腺激素綜合癥,機(jī)體GnRH分泌障礙,第二性征發(fā)育遲緩或不發(fā)育,動(dòng)物初情期啟動(dòng)失敗。此外,NKB和NK3R能夠促進(jìn)LH和FSH的分泌,參與卵巢排卵,進(jìn)一步說(shuō)明TAC3是動(dòng)物初情期啟動(dòng)的主效基因之一。本研究分析母豬初情期啟動(dòng)相關(guān)基因TAC3的表達(dá)調(diào)控機(jī)理,并探索雌激素通過(guò)雌激素反應(yīng)原件調(diào)控TAC3表達(dá)的機(jī)制,為解析母豬的初情期啟動(dòng)機(jī)制和改善母豬的繁殖性能提供分子依據(jù),為人類青春期的研究提供基礎(chǔ)。本研究以初情期前(180 d)、初情期(200 d)和初情期后(215 d)長(zhǎng)大二元雜母豬為研究對(duì)象,通過(guò)qRT-PCR定量分析在初情期啟動(dòng)過(guò)程中TAC3基因在母豬下丘腦、垂體、卵巢組織中mRNA水平的表達(dá)變化。并構(gòu)建TAC3基因啟動(dòng)子缺失片段的雙熒光素酶報(bào)告基因載體,轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞,通過(guò)雙熒光素酶活性分析確定核心啟動(dòng)子區(qū)域,利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)免疫共沉淀(ChIP)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子區(qū)的作用。構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子CDS區(qū)表達(dá)載體和干擾RNA轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞,qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)TAC3基因m RNA水平和蛋白水平變化;缺失TAC3基因啟動(dòng)子區(qū)域雌激素應(yīng)答元件以及用雌激素處理的方法分析雌激素受體對(duì)基因的調(diào)控作用。具體研究結(jié)果如下:(1)母豬初情期啟動(dòng)時(shí)TAC3基因在性腺軸(下丘腦、垂體、卵巢)組織中的mRNA水平表達(dá)上調(diào),到初情期后表達(dá)量逐漸減少,說(shuō)明TAC3基因可能參與促進(jìn)母豬初情期啟動(dòng)的調(diào)控。(2)克隆TAC3基因啟動(dòng)子片段-2815/+129區(qū)域全長(zhǎng)2943 bp,TAC3基因啟動(dòng)子-882/-544區(qū)域存在正向調(diào)控元件的結(jié)合位點(diǎn),-1633/-2482區(qū)域存在負(fù)向調(diào)控元件的結(jié)合位點(diǎn);(3)ChIP結(jié)果表明TAC3基因啟動(dòng)子-653/-639區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的結(jié)合位點(diǎn),超表達(dá)C/EBPβ后TAC3基因啟動(dòng)子活性增強(qiáng),TAC3基因mRNA和蛋白水平表達(dá)增加。干擾C/EBPβ表達(dá)后TAC3基因啟動(dòng)子活性降低,TAC3基因mRNA和蛋白水平表達(dá)降低,說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ促進(jìn)TAC3基因的表達(dá)。TAC3基因啟動(dòng)子-873/-856區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因YY1的結(jié)合位點(diǎn)。超表達(dá)YY1后TAC3基因啟動(dòng)子活性增強(qiáng),TAC3基因mRNA和蛋白水平表達(dá)上調(diào)。干擾YY1表達(dá)后TAC3基因啟動(dòng)子活性降低,TAC3基因mRNA和蛋白水平表達(dá)下調(diào),雖然YY1的作用不顯著,但是也可看出促進(jìn)TAC3基因的表達(dá)的趨勢(shì),說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子YY1可能促進(jìn)TAC3基因的表達(dá)。(4)雌激素處理后TAC3基因啟動(dòng)子活性降低,TAC3基因mRNA和蛋白水平表達(dá)下調(diào)。缺失TAC3基因啟動(dòng)子區(qū)-2122/-2112潛在的雌激素應(yīng)答元件,TAC3基因啟動(dòng)子活性升高,說(shuō)明雌激素作用于TAC3基因啟動(dòng)子區(qū)雌激素應(yīng)答元件抑制TAC3基因的表達(dá)。本研究得到結(jié)論如下:(1)下丘腦、垂體、卵巢組織中TAC3基因在初情期啟動(dòng)時(shí)具有較高的表達(dá)量,說(shuō)明NKB可能與初情期的啟動(dòng)相關(guān);(2)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ作用于TAC3基因啟動(dòng)子-653/-639區(qū)域C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn),促進(jìn)TAC3基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,YY1通過(guò)TAC3基因啟動(dòng)子-873/-856區(qū)域的YY1結(jié)合位點(diǎn)可能促進(jìn)TAC3基因的表達(dá)。(3)雌激素可能與雌激素受體結(jié)合作用于在TAC3基因啟動(dòng)子-2122/-2112區(qū)域的雌激素應(yīng)答元件,抑制TAC3基因的轉(zhuǎn)錄。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1337209