本文關(guān)鍵詞：人源化基因修飾豬內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定　出處：《西北民族大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 小型豬 異種移植 主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞 CD31

【摘要】：異種移植(Xenotransplantation)是解決臨床器官供體短缺的重要途徑之一,豬被認(rèn)為是人類異種器官移植的理想供體。然而,豬器官應(yīng)用于人類器官移植方面卻面臨著多種排斥反應(yīng)。將豬的α-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因(0α-1,3GT)敲除及轉(zhuǎn)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46能基本克服超急性排斥,但是仍然存在急性血管排斥反應(yīng)和凝血紊亂等問題,其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是介導(dǎo)放大免疫排斥反應(yīng)及凝血功能紊亂的重要環(huán)節(jié)。在豬到狒狒的肝移植中發(fā)現(xiàn),受體在術(shù)后出現(xiàn)嚴(yán)重的血小板減少性內(nèi)出血,初步發(fā)現(xiàn)血小板的減少與肝臟中肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬有關(guān)。本研究分離培養(yǎng)了豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Porcine arterial endothelial cell, pAEC)和豬肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(Porcine liver sinusoidal endothelial cell, pLSEC)建立了豬肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分離純化的方法,為在體外研究異種移植免疫排斥奠定了基礎(chǔ)。利用課題組創(chuàng)建GGTA1、ASGR1、CMAH基因敲除的和轉(zhuǎn)入hCD46、hTBM基因的異種移植小型豬,分離培養(yǎng)pAEC和pLSEC,并對(duì)GGTA1、ASGR1、 CMAH、hCD46在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行流式分析。利用FITC-CD31流式細(xì)胞分析pAEC和pLSEC的純度,掃描電鏡和透射電鏡觀察pLSEC窗孔結(jié)構(gòu),免疫熒光法檢測(cè)pAEC、pLSEC攝取DiI標(biāo)記的乙�；兔芏戎鞍�(DiI-Ac-LDL)的內(nèi)吞功能,實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time PCR, qRT-PCR)檢測(cè)pLSEC、pAEC、豬耳成纖維細(xì)胞(Porcine ear fibroblast cell, pEFC)的CD31、CD146、Ⅷ因子、vWF因子的表達(dá)。采用端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄的酶(Telomerase reverse transcripatase of human, hTERT)對(duì)pAEC進(jìn)行永生化。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)多基因修飾豬的相關(guān)基因GGTA1、ASGR1、CMAH、hCD46在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)進(jìn)行分析。研究結(jié)果如下：(1)分離培養(yǎng)的pAEC呈典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài),鋪路石樣排列,生長(zhǎng)狀態(tài)良好；pAEC吸收Dil-Ac-LDL,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明培養(yǎng)第3代的pAEC表達(dá)CD31的純度高達(dá)99.8%。(2)利用CD31作為肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記來分離豬肝竇內(nèi)皮細(xì)胞,得到的pLSEC呈內(nèi)皮細(xì)胞的典型形態(tài),鋪路石樣排列,具有標(biāo)志性的窗孔結(jié)構(gòu)；pLSEC具有DiI標(biāo)記的乙�；兔芏戎鞍�(DiI-Ac-LDL)的內(nèi)吞功能；培養(yǎng)第3代的pLSEC表達(dá)CD31高達(dá)96.3%,說明pLSEC傳代培養(yǎng)的穩(wěn)定性高、純度達(dá)96.3%。pLSEC表達(dá)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子CD146、Ⅷ因子、vWF, pLSEC表達(dá)CD31、CD 146、Ⅷ因子、vWF表達(dá)量顯著高于pAEC和豬耳成纖維細(xì)胞(Porcine ear fibroblast cell, pEFC)。(3)質(zhì)粒pCI-neo-hTERT電轉(zhuǎn)染pAEC后,細(xì)胞已傳代至第14代,pAEC永生化后保持了正常的血管內(nèi)皮的生物學(xué)特性。(4)通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)GGTA1、ASGR1、CMAH基因敲除和轉(zhuǎn)入hCD46基因的用于異種移植的小型豬基因在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行分析,表明多基因修飾豬的無GGTA1、ASGR1、CMAH基因相關(guān)蛋白的表達(dá),hCD46基因修飾豬表達(dá)hCD46蛋白。總之,本研究成功建立了多種基因修飾豬的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞,利用CD31來純化pAEC,同時(shí)轉(zhuǎn)入pCI-neo-hTERT,得到永生化的pAECo確定了CD31可作為分離純化pLSEC的特異性標(biāo)記分子。pAEC和pLSEC為研究非Gal抗原以及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血小板吞噬的問題提供了良好的細(xì)胞模型。利用流式細(xì)胞分析的方法對(duì)多基因修飾豬的GGTA1、ASGR1、CMAH基因敲除和hCD46基因轉(zhuǎn)入進(jìn)行檢測(cè),提供了一種快速、準(zhǔn)確的鑒定多基因修飾豬的方法。
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q813.11

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本文編號(hào)：1332285