本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻MSA和MSB對非靶標(biāo)害蟲褐飛虱和白背飛虱的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》 2007年

Cry1A蛋白在轉(zhuǎn)基因棉花—抗性棉鈴蟲—中紅側(cè)溝繭蜂食物鏈間的傳遞與定位

陳洋  

【摘要】： 本文以轉(zhuǎn)cry1A基因棉花(或加入Cry1Ac蛋白的人工飼料)-抗性棉鈴蟲-中紅測溝繭蜂為食物鏈傳遞模式，通過ELISA和免疫組織化學(xué)技術(shù)研究Cry1A蛋白在寄主昆蟲及其寄生性天敵昆蟲間的運動和積累。同時，研究了Cry1A蛋白對中紅側(cè)溝繭蜂的生物學(xué)影響及Cry1A蛋白在不同器官中的定位分布及傳遞，為合理評價轉(zhuǎn)基因植物潛在的生態(tài)風(fēng)險提供依據(jù)。主要結(jié)果如下： 利用重疊PCR方法擴增得到了約2.5 kb的產(chǎn)物(cry1Ac-GFP融合基因，cry1Ac片斷大小為1776 bp，GFP片斷大小為714 bp)，構(gòu)建了pGEX／cry1Ac-GFP原核表達載體，表達了大小約為114kD可以產(chǎn)生綠色熒光的融合蛋白。 棉鈴蟲取食轉(zhuǎn)cry1Ac基因棉花Nuctn 33B(簡稱33B)和轉(zhuǎn)GFMcry1A+CDTI棉花sGK321葉片后，棉鈴蟲的生長發(fā)育受到抑制，中紅側(cè)溝繭蜂的卵-幼蟲歷期延長，結(jié)繭率降低，成蟲壽命縮短。同時，兩種轉(zhuǎn)基因棉花處理之間在卵-幼蟲歷期、繭重、結(jié)繭率和成蟲體重有顯著差異。中紅側(cè)溝繭蜂寄生取食Cry1Ac蛋白含量為4ug／g的人工飼料的棉鈴蟲(簡稱20.0抗性品系)后，中紅側(cè)溝繭蜂的成蟲壽命縮短，中紅側(cè)溝繭蜂寄生取食Cry1Ac蛋白含量為40ug／g的的人工飼料的棉鈴蟲(簡稱高毒飼料品系)后，中紅側(cè)溝繭蜂的卵-幼蟲歷期延長、結(jié)繭率下降、繭重減輕、成蟲壽命縮短、羽化率降低和成蟲體重減輕。 用ELISA方法在取食33B棉花和sGK321棉花葉片的抗性棉鈴蟲和20.0抗性品系及高毒飼料品系的抗性棉鈴蟲1～5齡幼蟲體內(nèi)可以檢測到微量的Cry1A毒蛋白，大部分的毒蛋白存在于糞便中，被排泄出體外，5齡幼蟲的中腸組織和中腸內(nèi)含物中也有Cry1A毒蛋白被檢出。在取食33B棉花葉片和毒飼料的抗性棉鈴蟲5齡幼蟲的血淋巴中檢測到微量的Cry1Ac毒蛋白，蛋白含量分別是：鮮重10.52±0.39ng／g和鮮重13.86±1.12ng／g。在寄生取食33B棉花葉片和毒飼料的抗性棉鈴蟲的中紅側(cè)溝繭蜂的老熟幼蟲體內(nèi)檢測到微量的Cry1Ac蛋白，蛋白含量分別是：鮮重10.46±0.53ng／g和10.52±0.68ng／g。測定毒飼料處理與常規(guī)飼料處理的棉鈴蟲血淋巴中的可溶性總蛋白含量，結(jié)果表明，毒飼料處理的血淋巴中的可溶性總蛋白含量要比常規(guī)處理的低。取食轉(zhuǎn)基因棉花葉片處理間的抗性棉鈴蟲1～5齡幼蟲的Cry1Ac毒蛋白占總蛋白的比值變化趨勢不同，而20.0抗性品系和高毒飼料品系的1～5齡幼蟲體內(nèi)的Cry1Ac毒蛋白占總蛋白的比值逐漸降低。 從冰凍切片圖和免疫定位圖片結(jié)果可以看出Cry1Ac蛋白在抗性棉鈴蟲體內(nèi)的主要結(jié)合部位是中腸的刷狀緣膜囊(brush border membrane vesicles，簡稱BBMV)。 以上研究為探索轉(zhuǎn)基因重組蛋白在三級營養(yǎng)食物鏈間的傳遞和定位提供了依據(jù)，為進一步研究轉(zhuǎn)抗蟲基因棉花對昆蟲食物鏈(網(wǎng))的影響奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：S435.622
【目錄】：

摘要5-6

Abstract6-11

第一章 文獻綜述11-21

1.1 引言11

1.2 轉(zhuǎn)基因植物外源DNA和蛋白的環(huán)境行為11-13

1.3 轉(zhuǎn)基因植物對非靶標(biāo)害蟲的影響13-15

1.4 轉(zhuǎn)基因植物對捕食性天敵的影響15-17

1.5 轉(zhuǎn)基因植物對寄生性天敵的影響17-18

1.6 轉(zhuǎn)基因植物花粉對其他有益昆蟲的影響18-19

1.7 轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物的影響19

1.8 本論文研究的目的及意義19-21

第二章 研究內(nèi)容和技術(shù)路線21-22

2.1 主要研究內(nèi)容21

2.1.1 CrylA-GFP融合蛋白的原核表達21

2.1.2 轉(zhuǎn)crylA基因棉花/CrylA蛋白對中紅側(cè)溝繭蜂的生物學(xué)影響21

2.1.3 CrylA蛋白在食物鏈間的傳遞與定位21

2.2 研究的技術(shù)路線21-22

第三章 轉(zhuǎn)crylA基因棉花/CrylA蛋白對中紅側(cè)溝繭蜂的生物學(xué)影響22-26

3.1 材料22-23

3.1.1 供試蟲源22

3.1.2 供試棉花22-23

3.2 實驗方法23

3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析23

3.4 結(jié)果與分析23-25

3.4.1 轉(zhuǎn)基因棉花對中紅側(cè)溝繭蜂生物學(xué)參數(shù)的影響23-24

3.4.2 CrylA蛋白對中紅側(cè)溝繭蜂生物學(xué)參數(shù)的影響24-25

3.5 小結(jié)25-26

第四章 crylAc-GFP融合蛋白的原核表達26-38

4.1 材料與試劑26-29

4.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)基26

4.1.2 菌株與質(zhì)粒26-27

4.1.3 質(zhì)粒DNA抽提液27

4.1.4 瓊脂糖凝膠電泳緩沖液27

4.1.5 主要試劑27-28

4.1.6 部分儲存液配方28-29

4.1.7 儀器設(shè)備29

4.2 實驗方法29-34

4.2.1 crylAc和GFP的擴增29-31

4.2.2 重疊PCR產(chǎn)物連接到pMD-18載體31

4.2.3 轉(zhuǎn)化31-32

4.2.4 質(zhì)粒DNA的提取32

4.2.5 檢測32-33

4.2.6 原核表達載體pGEX/crylAc-GFP的構(gòu)建33

4.2.7 crylAc-GFP融合基因在E.coli中的表達33-34

4.2.8 crylAc-GFP融合蛋白鑒定34

4.3 結(jié)果與分析34-38

4.3.1 原核表達載體的構(gòu)建過程及鑒定34-35

4.3.2 融合蛋白SDS-PAGE檢測和Western-blot分析35-38

第五章 CrylA蛋白在食物鏈間的傳遞與定位38-53

5.1 材料39

5.1.1 供試棉花39

5.1.2 供試棉鈴蟲和中紅側(cè)溝繭蜂39

5.2 試劑與儀器設(shè)備39-40

5.2.1 ELISA試劑盒39

5.2.2 主要試劑39-40

5.2.3 主要儀器設(shè)備40

5.3 實驗方法40-42

5.3.1 樣品采集40

5.3.2 ELISA測定CrylA蛋白含量40

5.3.3 可溶性總蛋白含量的測定40-41

5.3.4 免疫定位41-42

5.4 結(jié)果與分析42-50

5.4.1 CrylA蛋白含量42-45

5.4.2 可溶性總蛋白含量45-47

5.4.3 CrylA毒蛋白占可溶性總蛋白的比值47-48

5.4.4 CrylA蛋白在抗性棉鈴蟲體內(nèi)的定位48-50

5.5 小結(jié)50-53

第六章 全文結(jié)論與討論53-56

參考文獻56-65

致謝65-66

作者簡歷66

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2 周秋菊;轉(zhuǎn)Bt基因棉花對主要害蟲和天敵的影響及其機理初探[D];華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

3 馬海芹;轉(zhuǎn)Bt基因棉對棉田非靶標(biāo)生物及次要害蟲的影響研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

4 萬鵬;長江中游棉區(qū)轉(zhuǎn)Cry1A基因棉花殺蟲蛋白表達及對靶標(biāo)和非靶標(biāo)害蟲的影響[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2004年

5 林珠鳳;淡足側(cè)溝繭蜂Microplitis pallidipes生物學(xué)及其利用的初步研究[D];華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

6 康曉霞;棉大卷葉螟主要內(nèi)寄生蜂的生物學(xué)習(xí)性及其與不同棉花品種關(guān)系的研究[D];揚州大學(xué);2006年

7 楊俊杰;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙價抗蟲基因Pta-CrylAc番茄的遺傳轉(zhuǎn)化研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

8 吳研;轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米對天敵昆蟲的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

9 張小麗;轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對甜菜夜蛾種群增長的影響及機理探討[D];揚州大學(xué);2008年

【二級引證文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李廣云;李海強;郭艷蘭;楊帥;李晶晶;夏偉;張建萍;;轉(zhuǎn)基因棉對土耳其斯坦葉螨生命參數(shù)的影響[J];應(yīng)用昆蟲學(xué)報;2013年02期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 路獻勇;六種Bt蛋白對三種棉花害蟲的殺蟲活性及安全性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

【二級參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陸永躍,褚蘭娥,尹楚道;轉(zhuǎn)Bt基因棉的抗蟲特性和棉鈴蟲治理對策[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2000年02期

2 施文,姚衛(wèi)平,劉道貴,周方,何援華;斜紋夜蛾在轉(zhuǎn)Bt棉花品種上發(fā)生情況的初步研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2004年02期

3 李景文,劉慶年,金宗亭,張路生,周霞;轉(zhuǎn)BT基因棉與常規(guī)棉主要害蟲及天敵消長規(guī)律的觀察[J];濱州教育學(xué)院學(xué)報;2000年03期

4 商建農(nóng),朱俊慶,葉恭銀;茶尺蠖核型多角體病毒與農(nóng)藥混用試驗[J];茶葉;1999年02期

5 張光裕;我國棉鈴蟲病毒殺蟲劑的研究開發(fā)和應(yīng)用[J];長江流域資源與環(huán)境;1994年01期

6 廖兵,周世文,李國保;九十年代棉鈴蟲的發(fā)生特點及原因[J];湖北植保;2000年01期

7 鐵巖，焦金玉，馬瑞霞，陳現(xiàn)臣，張守新;棉鈴蟲對棉鈴蟲核型多角體病毒著藥方式與死亡率關(guān)系的研究[J];河南農(nóng)業(yè)科學(xué);1994年11期

8 周延清,張根發(fā),蔣達和,張進忠;農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因進入油菜的研究[J];河南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);1997年03期

9 謝道昕,范云六,倪萬潮,黃駿麒;蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)殺蟲晶體蛋白基因?qū)朊藁ǐ@得轉(zhuǎn)基因植株[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1991年04期

10 郭慧芳,孫洪武,朱述鈞,方繼朝;轉(zhuǎn)基因棉對非靶標(biāo)害蟲棉蚜適合度研究[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報;2003年01期

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