本文關鍵詞：微生物16S rRNA基因序列分類單元（OTUs）聚類算法的設計與實現(xiàn)

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【摘要】：隨著第二代測序技術的發(fā)展,針對微生物16S rRNA基因的高通量測序除用于人類健康的研究外,在畜牧業(yè)生產的各領域也得到了廣泛地應用,比如研究腸道微生物結構與宿主經濟性狀間的關系。該方法有效克服了傳統(tǒng)技術的缺陷,但隨之而來的困難則在于對海量數(shù)據(jù)的分析。在16S rRNA測序數(shù)據(jù)的分析中,最關鍵的一個環(huán)節(jié)即是基于序列間相似度的分類單元(Operational taxonomic units, OTUs)聚類,從而用于代表在種或屬等分類學水平上的不同物種,其準確程度顯著影響到后續(xù)分析結果的可靠性。目前已有針對OTUs聚類的算法及軟件(如Mothur和UPARSE),但存在假陽性率高、噪音信號強以及很難從生物學角度進行結果解釋等問題。因此,本實驗針對目前主流軟件存在的問題,對OTUs的聚類算法進行了優(yōu)化設計,并采用C和Python編程語言開發(fā)出以先注釋后聚類為特點的分析軟件(bioOTU);同時,基于模擬和真實數(shù)據(jù)對bioOTU的準確性與Mothur和UPARSE進行了系統(tǒng)地比較。主要結果如下：(1) bioOTU的算法設計針對通過前期質量控制后得到的干凈序列(Clean tags),對所有樣本進行合并后去冗余,得到非冗余序列(Unique tags),并記錄每條tag的絕對豐度和樣本豐度兩個信息。將所有的Unique tags同源比對到參考數(shù)據(jù)庫中,基于Bayes算法在屬水平上進行物種注釋,從而將所有序列區(qū)分為能被成功注釋和無法被注釋兩種情況。隨后,對被成功注釋到同一屬中的所有Unique tags進行兩兩間比對,計算序列間的距離(包括k-mer巨離和遺傳距離),依據(jù)用戶指定的閾值(如0.03)進行OTUs聚類。在此基礎上,針對無法被注釋的tags,計算它們與在上一步中已得到的OTUs司的平均連接距離(Average linkage distance),同樣依據(jù)用戶指定的閾值判定是否可以加入到已有的OTUs中。從序列注釋開始,將以上步驟在不同分類學水平上(屬、科、目等)逐級迭代運行,從而得到所有在分類學上已知的OTUs.隨后,針對剩下的所有Unique tags,首先使用UCHIME算法進行嵌合體(Chimeras)序列的檢測,然后依據(jù)絕對豐度和樣本豐度兩個信息對所有的tags進行排序,采用自下而上的啟發(fā)式搜索算法(Heuristic algorithm)進行OTUs的從頭聚類(de novo clustering),最后得到在分類學上未知的OTUs。(2) bioOTU的軟件實現(xiàn)基于Python語言的靈活性與C語言的高效性,本實驗采用Python語言搭建bioOTU的主體框架,且以腳本化運行的方式設計實現(xiàn)所有的分析環(huán)節(jié)。由于序列比對環(huán)節(jié)需要巨大的計算量,因此采用C語言從最底層改寫遺傳距離計算等核心環(huán)節(jié),同時采用多線程并行計算的設計,從而極顯著地提高了計算效率。另外,充分考慮軟件使用的友好性,用戶只需輸入質量控制后的Clean tags, bioOTU在OTUs聚類完成后自動輸出所有OTUs的注釋信息以及在每個樣本(或分組)中的豐度值,即同時實現(xiàn)了OTUs的聚類與注釋。bioOTU提供免費下載使用,支持在類Unix操作系統(tǒng)上運行。(3) bioOTU的聚類效果比較分析利用人工模擬微生物群落(Mock community,共包含21個預定物種)的16S rRNA高通量測序數(shù)據(jù),分別使用bioOTU、Mothur和UPARSE進行OTUs聚類,均采用默認或推薦的參數(shù)。結果發(fā)現(xiàn),bioOTU、Mothur和UPARSE共輸出74、311和28個OTUs,其中分別有18、15和18個OTUs被成功注釋到預定物種上。通過計算每個OTUs的豐度值并與期望值進行比較,結果發(fā)現(xiàn)三個軟件得到的物種相對豐度值與期望值間均具有較好的一致性。利用腸道微生物16S rRNA高通量測序的真實數(shù)據(jù),對三個軟件進行比較分析。結果發(fā)現(xiàn),bioOTU得到了最少的OTUs數(shù)量(624個,對比于Mothur的5268,UPARSE的922)。bioOTU和UPARSE在OTUs豐度值上總體接近,但均顯著高于Mothur輸出OTUs的豐度值�；谕磳Ρ犬a生金標準序列集,從而計算并使用歸一化互信息值(NMI)判定軟件聚類結果的準確性。結果顯示,bioOTU的NMI值(0.914)要比Mothur的NMI值(0.922)低,但高于UPARSE (0.903)。因此,比較分析結果支持bioOTU的聚類準確性在總體上與該領域的主流軟件相當,但在某些指標上則具有更好的表現(xiàn)。
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q811.4

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本文編號：1280949