本文關(guān)鍵詞：表達(dá)EGFP報(bào)告基因口蹄疫病毒亞基因組復(fù)制子的構(gòu)建

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【摘要】：【目的】構(gòu)建含有EGFP報(bào)告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亞基因組復(fù)制子系統(tǒng)�！痉椒ā坷萌诤螾CR方法,將EGFP報(bào)告基因替換O型FMDV全長(zhǎng)c DNA克隆中的前導(dǎo)蛋白Lb和結(jié)構(gòu)蛋白P1基因,構(gòu)建含有EGFP報(bào)告基因的FMDV亞基因組復(fù)制子FMDV-EGFP。復(fù)制子質(zhì)粒連續(xù)轉(zhuǎn)化、測(cè)序檢驗(yàn)復(fù)制子載體的穩(wěn)定性。Not I線(xiàn)性化的復(fù)制子FMDV-EGFP用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染表達(dá)T7 RNA聚合酶的BSR/T7細(xì)胞后,不同時(shí)間段觀察EGFP熒光表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用流式、間接免疫熒光、RT-PCR和Western blot檢測(cè)該復(fù)制子載體的自主復(fù)制能力和口蹄疫病毒蛋白的表達(dá)情況�！窘Y(jié)果】復(fù)制子質(zhì)粒的連續(xù)轉(zhuǎn)化及測(cè)序表明報(bào)告基因可以穩(wěn)定存在。FMDV-EGFP復(fù)制子轉(zhuǎn)染BSR/T7細(xì)胞3 h后在熒光顯微鏡下能夠看到綠色熒光,EGFP熒光信號(hào)隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,并且熒光信號(hào)可持續(xù)6 d以上。轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞流式分析顯示轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中有6.0%發(fā)出熒光,說(shuō)明構(gòu)建的復(fù)制子載體能夠有效表達(dá)EGFP蛋白。另外,間接免疫熒光、RT-PCR和Western blot方法也檢測(cè)到該復(fù)制子RNA在BSR/T7細(xì)胞中能夠進(jìn)行自主復(fù)制,并且能夠表達(dá)病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白�！窘Y(jié)論】含有EGFP報(bào)告基因的FMDV亞基因組復(fù)制子的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究病毒復(fù)制、翻譯機(jī)制及篩選抗病毒藥物等奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【作者單位】： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室;甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院;
【基金】：甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目(No.GNSW-2015-26;GNSW-2014-22) 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(No.1204NKCA109)~~
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;S852.65
【正文快照】： Foundation item:Gansu Province Agricultural Biotechnology Research and Development Project(No.GNSW-2015-26,GNSW-2014-22);The Central Level Public Welfare Scientific Research Institutes for Basic ScientificResearch Special Fund(No.1204NKCA109)*Correspondi，

本文編號(hào)：1258019