本文關(guān)鍵詞：大豆硫苷代謝功能基因GmSOT1的遺傳轉(zhuǎn)化與功能鑒定

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【摘要】：大豆[Glycine max(L.)],雙子葉植物綱豆科大豆屬植物,為重要的糧油兼用作物。隨著全球氣候變化和農(nóng)藥過(guò)度的使用,大豆生產(chǎn)中病蟲害日益加重。為了從源頭尋找理想的大豆抗病蟲相關(guān)基因,培育抗病蟲大豆新品種,我們開(kāi)展了大豆次生代謝相關(guān)的抗病蟲害基因的挖掘工作。硫代葡萄糖苷(Glucosinolate,簡(jiǎn)稱硫苷)是一種于十字花科植物中發(fā)現(xiàn)的次生代謝產(chǎn)物,其水解產(chǎn)物具有抑制細(xì)菌、真菌增殖和抗蟲等功能。而關(guān)于大豆中硫苷抗病蟲功能的相關(guān)研究報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn),在大豆根瘤中存在硫苷代謝途徑,并首次從大豆根瘤中克隆出硫苷代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因—磺酸基轉(zhuǎn)移酶基因GmSOT1。而GmSOT1基因的過(guò)表達(dá)是否會(huì)增加大豆植株中的硫苷含量從而提高其抗病蟲的能力則尚未見(jiàn)報(bào)道。雖然轉(zhuǎn)基因大豆已在全球范圍大面積種植,但其遺傳轉(zhuǎn)化仍是具體實(shí)施的難點(diǎn)。盡管從理論上利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因轉(zhuǎn)入大豆可縮短大豆良種選育進(jìn)程,然而目前大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率仍極低,主要原因歸咎為：1)大豆離體培養(yǎng)植株再生困難；2)實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)性差；3)受體基因型間差異明顯和轉(zhuǎn)入基因的依賴性強(qiáng)；4)培養(yǎng)條件復(fù)雜,這極大程度地桎梏了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行的大豆遺傳改良。因此,建立一種高效的大豆離體培養(yǎng)再生體系,并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),是目前大豆遺傳轉(zhuǎn)化中亟待解決的一個(gè)難題。本研究以大豆K06-82胚尖為起始外植體,開(kāi)展了大豆高效離體培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化,對(duì)以大豆胚尖為受體系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行了改良,并進(jìn)行了大豆GmSOT1的遺傳轉(zhuǎn)化,然后利用GUS染色、PCR檢測(cè)、Southern blot雜交等方法對(duì)轉(zhuǎn)GmSOT1基因的抗性植株進(jìn)行了分析；初步鑒定了GmSOT1基因轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲效果,同時(shí)測(cè)定了GmSOT1基因轉(zhuǎn)基因植株的酶活水平,試驗(yàn)結(jié)果如下：1.建立了大豆K06-82的高效、穩(wěn)定再生體系：以氯氣消毒法獲取外植體胚尖,以MSB5為基本培養(yǎng)基,不定芽誘導(dǎo)時(shí)先在附加3.0 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)的培養(yǎng)基上光下培養(yǎng)5 d,再轉(zhuǎn)接至附加0.5 mg/L 6-BA和0.05 mg/L萘乙酸(NAA)的培養(yǎng)基上,2W繼代一次;不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為：MSB5+0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L赤霉素(GA3),2W繼代一次；不定芽生根時(shí)培養(yǎng)基配方為：1/2MSB5+1.0 mg/L吲哚丁酸(IBA),該方法適用于帶胚軸不定芽和不帶胚軸不定芽生根,生根效率均達(dá)到96.7%左右。2.大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化：對(duì)K06-82胚尖進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí),預(yù)培養(yǎng)時(shí)間以24 h為宜,最佳侵染方法是28℃、200 r/min條件下侵染1 h,共培養(yǎng)時(shí)乙酰丁香酮(AS)使用濃度為200μmol/L,適合大豆K06-82轉(zhuǎn)基因抗性芽生根的IBA濃度為1.2 mg/L,不帶下胚軸的不定芽生根率高于攜帶下胚軸的不定芽生根率。隨后用優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化方法將GmSOT1基因轉(zhuǎn)入K06-82胚尖,遺傳轉(zhuǎn)化效率達(dá)25.1%。3.大豆GmSOT1抗性植株的分子鑒定和抗蟲性測(cè)試：利用GUS染色和PCR檢測(cè)方法,初步證明GmSOT1基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入大豆基因組中；再用Southern blot分子檢測(cè)方法,確定GmSOT1基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入大豆基因組中。從而,獲得大豆GmSOT1轉(zhuǎn)基因植株。利用已獲得大豆GmSOT1轉(zhuǎn)基因植株,開(kāi)展抗蟲性測(cè)試。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)基因植株葉片危害等級(jí)均降低,幼蟲平均體重降低且死亡率增加,而不同轉(zhuǎn)基因株系之間的抗蟲性存在一定差異。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S565.1

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