發(fā)布時間：2017-12-03 10:27

  本文關(guān)鍵詞：柑橘衰退病毒基因p23 RNAi載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

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【摘要】：【目的】構(gòu)建柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含p23的RNAi載體,以獲得具有抗性的柑橘轉(zhuǎn)基因植株�！痉椒ā炕谵D(zhuǎn)化病毒基因介導(dǎo)抗性,根據(jù)NCBI公布的CTV基因組序列,查找p23保守序列,設(shè)計并克隆兩條不同長度的片段。對兩條片段和植物表達(dá)載體p BI 121進(jìn)行雙酶切和連接來構(gòu)建RNAi載體。初步預(yù)測所構(gòu)建的載體發(fā)生RNAi抗病毒的可行性。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)技術(shù)將含RNAi載體的農(nóng)桿菌注射入CTV指示植物墨西哥萊蒙的葉片,利用GUS組織化學(xué)染色法觀察葉片中載體發(fā)生瞬時表達(dá)的情況。發(fā)生瞬時表達(dá)的葉片接種CTV T36基因型,利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)檢測病毒含量。同時,提取葉片的RNA并反轉(zhuǎn)錄為c DNA,利用實(shí)時熒光定量PCR(q-PCR)檢測CTV p20,通過該基因的表達(dá)量反映葉片中的病毒含量。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將RNAi載體轉(zhuǎn)入大紅甜橙實(shí)生苗上胚軸節(jié)間莖段,抗生素篩選得到的芽嫁接至枳橙實(shí)生試管苗。提取大紅甜橙葉片的DNA,通過PCR擴(kuò)增確定其是否為轉(zhuǎn)基因陽性;目的基因檢測為陽性的植株二次嫁接至溫室保存的酸橙實(shí)生苗;根據(jù)插入的p23基因序列設(shè)計q-PCR引物,檢測轉(zhuǎn)基因植株中p23的表達(dá)情況。取CTV T36基因型寄主的帶皮芽,用腹接法接種大紅甜橙轉(zhuǎn)基因植株。取接種后新萌發(fā)枝梢上的葉片,用檢測瞬時表達(dá)葉片同樣的方法分析植株的抗病性。對于第1次接種后未檢測出病毒感染的植株,進(jìn)行第2次接種并檢測分析�！窘Y(jié)果】克隆得到CTV p23 513 bp的長片段和291 bp的短片段,與載體p BI121連接后成功構(gòu)建含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的來自病原且能靶向目的基因的RNAi載體,命名為p23-RNAi。注射p23-RNAi的墨西哥萊蒙葉片經(jīng)GUS染色后能夠產(chǎn)生藍(lán)色斑點(diǎn),表明農(nóng)桿菌p23-RNAi可以在葉片中發(fā)生瞬時表達(dá);接種CTV后第15和30天,瞬時表達(dá)p23-RNAi的墨西哥萊蒙葉片ELISA檢測結(jié)果均為陰性,同時q-PCR檢測結(jié)果顯示其CTV p20的積累水平和增加速度明顯低于對照植株,表明瞬時表達(dá)的p23-RNAi在一定時間內(nèi)可以對CTV的侵染產(chǎn)生抑制。p23-RNAi經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化大紅甜橙獲得抗性芽,通過普通PCR的擴(kuò)增結(jié)果證明得到7個轉(zhuǎn)基因植株;q-PCR檢測結(jié)果進(jìn)一步表明7個轉(zhuǎn)基因植株間p23的含量呈現(xiàn)一定差異,植株E的含量最高,其次是C、F、H、A、B和G。接種CTV后,p20的表達(dá)量在7個轉(zhuǎn)基因植株間也表現(xiàn)出一定差異,表達(dá)量最高的是植株A,其次是G、F、E、B、H、C,且與對照植株相比,呈現(xiàn)不同程度的抗病性。轉(zhuǎn)基因植株對病毒的抗性與外源基因的表達(dá)水平?jīng)]有相關(guān)性,外源基因表達(dá)水平最高的植株E并沒有表現(xiàn)強(qiáng)的CTV抗性。經(jīng)過兩次病毒接種,轉(zhuǎn)基因植株C在接種后具有完全抗性�！窘Y(jié)論】p23-RNAi載體能引起植物抗柑橘衰退病毒;瞬時表達(dá)技術(shù)可快速鑒定RNAi載體的抗病性,有利于篩選高效率的RNAi載體。
【作者單位】： 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/國家柑橘改良中心長沙分中心;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(30900972,3157211) 國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203076-06) 湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2013B290)
【分類號】：S436.66
【正文快照】： Construction and Transformation of RNAi Vector forCitrus tristeza virus Gene p23LI Fang,DENG Zi-niu,ZHAO Ya,LI Da-zhi,DAI Su-ming(Horticulture and Landscape College,Hunan Agricultural University/National Center for Citrus Improvement(Changsha),Changsha 4

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1 王盛;王楊;李志英;張虹;雒麗娜;董潔;王玉炯;;TBSV病毒瞬時表達(dá)載體構(gòu)建及其表達(dá)[J];寧夏大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2011年02期

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1 樊磊;小菜蛾顆粒體病毒瞬時表達(dá)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的構(gòu)建及其晚期表達(dá)因子在非受納細(xì)胞系Sf-9中的功能分析[D];華中師范大學(xué);2011年

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本文編號：1248394