本文關(guān)鍵詞：植物青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系統(tǒng)基因簇及相關(guān)基因功能研究

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【摘要】：茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物細(xì)菌性青枯病是世界性重大病害。該菌具有較廣的寄主范圍和地理分布,由青枯菌引起的植物病害造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步,人類已經(jīng)能夠從基因?qū)用嫫饰銮嗫菥闹虏C(jī)理,開辟出有效控制青枯菌危害的新途徑和新方法,為生產(chǎn)上防治青枯菌奠定理論基礎(chǔ)。Ⅵ型分泌系統(tǒng)(typeⅥsecretion system,T6SS)存在于各類細(xì)菌中,目前主要集中研究人類和動(dòng)物致病菌中的Ⅵ型分泌系統(tǒng),研究發(fā)現(xiàn)T6SS與病原菌的致病力、細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)及互作等多種生命活動(dòng)密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)T6SS核心基因參與了青枯菌的致病性。為深入探索T6SS在青枯菌中的功能,本文構(gòu)建了植物青枯菌Po82菌株的T6SS基因簇完全缺失菌株,從全局水平初步分析了T6SS的功能。植物青枯菌基因組中存在兩個(gè)Ⅰ型信號(hào)肽酶,信號(hào)肽酶對(duì)青枯菌蛋白的分泌起著至關(guān)重要的作用,為了更好的研究Ⅰ型信號(hào)肽酶在植物病原菌中的作用,探索青枯菌致病的分子機(jī)理,本文同時(shí)對(duì)青枯菌Po82菌株中兩個(gè)I型信號(hào)肽酶基因功能進(jìn)行了相關(guān)研究。1.基因缺失突變株和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),青枯菌Po82菌株中的兩個(gè)Ⅰ型信號(hào)肽酶都有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,其中基因1716編碼蛋白具有信號(hào)肽和兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域;而Lep B蛋白可能具有跨膜結(jié)構(gòu)域,但不具有信號(hào)肽。通過同源重組雙交換,構(gòu)建基因缺失載體和互補(bǔ)載體,并篩選獲得T6SS基因簇和Ⅰ型信號(hào)肽酶單基因缺失突變株,以及相應(yīng)的互補(bǔ)菌株。2.T6SS基因簇的功能分析在接種前期,突變株P(guān)o82ΔⅥ的致病力明顯減弱,后期致病能力逐漸恢復(fù),與野生型菌株相比差異不顯著;突變株P(guān)o82ΔⅥ的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率明顯減弱,生物膜形成能力沒有明顯差異,q RT-PCR分析鞭毛相關(guān)基因,突變株P(guān)o82ΔⅥ基因flh C、flh D和fnr的表達(dá)量明顯下調(diào),fli A基因表達(dá)量明顯上調(diào),運(yùn)動(dòng)能力顯著增強(qiáng);q RT-PCR分析Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因,與野生型菌株相比,差異不顯著。雖然T6SS在青枯菌的致病過程中發(fā)揮重要作用,但T6SS基因簇的缺失可能不影響Po82菌株的Ⅲ型效應(yīng)子基因的表達(dá)或影響很小。3.Ⅰ型信號(hào)肽酶基因的功能分析突變株P(guān)o82△1716致病力明顯減弱,生長(zhǎng)速率、運(yùn)動(dòng)能力顯著降低;q RT-PCR分析鞭毛及T3SS相關(guān)基因表達(dá)情況,鞭毛基因flh C、flh D和fnr的表達(dá)量明顯下調(diào),說明1716基因正向調(diào)控鞭毛相關(guān)基因的表達(dá);其Ⅲ型標(biāo)志效應(yīng)子基因表達(dá)量明顯下調(diào),說明1716基因影響病原菌Ⅲ型效應(yīng)子基因的表達(dá),使其致病力下降。而突變株P(guān)o82△lep B致病力明顯減弱,生長(zhǎng)速率、運(yùn)動(dòng)能力與野生型菌株相近;q RT-PCR分析鞭毛及T3SS相關(guān)基因表達(dá)情況,鞭毛相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào),說明lep B基因負(fù)向調(diào)控鞭毛相關(guān)基因的表達(dá);其Ⅲ型標(biāo)志效應(yīng)子pop A、B、C和pop P基因表達(dá)量明顯上調(diào),說明lep B基因負(fù)向調(diào)控Ⅲ型效應(yīng)子基因的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S432.42

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6 張麗R

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