本文關(guān)鍵詞：Purα對(duì)PARP1基因表達(dá)調(diào)控作用及在DNA損傷修復(fù)中作用機(jī)制研究

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【摘要】：目的:Purα是一種多功能蛋白質(zhì),在體內(nèi)的多個(gè)環(huán)節(jié)上都發(fā)揮著重要的作用,特別在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著更為重要的作用。Purα蛋白質(zhì)在對(duì)DNA損傷與修復(fù)中的作用是非常明顯的。有研究也表明在由復(fù)制叉終止引起的DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)修復(fù)中,Purα蛋白對(duì)修復(fù)的DNA起著監(jiān)督的作用,這有助于維持基因組的穩(wěn)定性,在神經(jīng)退行性病變的發(fā)生中有著重要的意義。Purα的表達(dá)有特異性,與神經(jīng)元的發(fā)育和突觸形成有密切的關(guān)系。PARP1是存在于真核細(xì)胞中催化聚ADP核糖化的核酶。它能識(shí)別極低水平的DNA損傷,激活相應(yīng)的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng),修復(fù)受損的DNA;而在DNA損傷嚴(yán)重時(shí),它能啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序,從而維持了細(xì)胞遺傳物質(zhì)的完整性。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí),Purα蛋白與PARP1蛋白有相互結(jié)合作用。然而,Purα蛋白是否調(diào)控PARP1基因的表達(dá),如何進(jìn)行調(diào)控,正調(diào)控還是負(fù)調(diào)控,Purα蛋白的活性功能域究竟位于什么地方,目前仍然不是十分清楚。我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^(guò)研究過(guò)表達(dá)Purα蛋白對(duì)PARP1基因表達(dá)的影響來(lái)確定Purα蛋白對(duì)PARP1基因表達(dá)的調(diào)控作用。同時(shí),通過(guò)研究Purα缺失突變體對(duì)PARP1基因的作用效果來(lái)確定Purα蛋白的活性結(jié)構(gòu)域。此外,我們也通過(guò)研究Purα缺失突變體對(duì)APP基因的作用效果進(jìn)一步來(lái)確定Purα蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用中的活性結(jié)構(gòu)域。方法(1)根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增Purα基因的不同的缺失片段,構(gòu)建與GFP融合表達(dá)的Purα缺失突變體(p EGFP-P1、p EGFP-P2、p EGFP-P3和p EGFP-P4)質(zhì)粒。(2)通過(guò)Pull down Assay和Co-IP,進(jìn)一步檢測(cè)Purα和PARP1的Physical interaction,即兩種蛋白之間是否存在實(shí)質(zhì)性的結(jié)合。(3)在HT22細(xì)胞中,通過(guò)Luciferase Assay,Real time PCR和Western blotting assay分別在啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平研究Purα蛋白及其結(jié)構(gòu)突變體對(duì)PARP1基因的調(diào)控作用。(4)用2m M的羥基脲(hydroxyurea,HU)建立HT22細(xì)胞DNA損傷模型,通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀察兩種蛋白在DNA損傷的細(xì)胞內(nèi)的分布。同時(shí),通過(guò)Western blotting assay研究過(guò)表達(dá)的Purα對(duì)PARP1蛋白的影響。(5)在HT22細(xì)胞中,通過(guò)研究過(guò)表達(dá)的Purα蛋白對(duì)m TOR通路中的信號(hào)分子的影響來(lái)探討Purα對(duì)PARP1蛋白的作用機(jī)制。結(jié)果(1)經(jīng)雙酶切鑒定和質(zhì)粒序列分析結(jié)果證明p EGFP-Purα缺失突變體質(zhì)粒構(gòu)建成功。(2)Pull down assay和Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Purα蛋白和PARP1蛋白存在相互結(jié)合作用。(3)Luciferase Assay、Real time PCR和Western blotting assay結(jié)果證實(shí)全長(zhǎng)Purα對(duì)PARP1基因有明顯的正向調(diào)控作用,四個(gè)突變體中P3對(duì)PARP1和APP的調(diào)控作用最為顯著。(4)DNA損傷模型下,Purα蛋白和PARP1蛋白存在共區(qū)域化的現(xiàn)象。同時(shí),Western blotting assay表明Purα蛋白可以促進(jìn)PARP1發(fā)揮其生物學(xué)功能,兩種蛋白對(duì)DNA損傷的修復(fù)有協(xié)同作用。(5)Western blotting assay發(fā)現(xiàn)Purα蛋白是通過(guò)m TOR通路來(lái)調(diào)控PARP1基因的表達(dá)。結(jié)論(1)Purα蛋白和PARP1蛋白之間有直接的結(jié)合作用(Physical interaction)。(2)Purα蛋白可以正向調(diào)控PARP1基因的表達(dá)。(3)N端富含甘氨酸區(qū)是Purα活性中心。(4)在DNA損傷后,Purα蛋白和PARP1蛋白會(huì)聚集到細(xì)胞核中相互協(xié)作完成對(duì)損傷的修復(fù)。并且,在此過(guò)程中Purα蛋白可以促進(jìn)PARP1發(fā)揮其生物學(xué)功能。(5)Purα蛋白是通過(guò)m TOR通路來(lái)調(diào)控PARP1基因的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 馬琳;周瑜;李永玲;柴娟;賈中發(fā);郭克;孫濤;崔建奇;;Egr-1對(duì)APP基因表達(dá)的調(diào)控作用[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2015年01期

2 ;Increased Levels of p53 and PARP-1 in EL-4 Cells Probably Related with the Immune Adaptive Response Induced by Low Dose Ionizing Radiation in vitro[J];Biomedical and Environmental Sciences;2010年06期

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本文編號(hào)：1222997