本文關(guān)鍵詞：家蠶bmo-miR-79對(duì)靶基因BmEm4表達(dá)調(diào)控的研究

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【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA,在生物體中起著至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。MiRNA通常是通過RISC復(fù)合物與靶基因mRNA的3’未翻譯區(qū)的靶位點(diǎn)序列互補(bǔ)結(jié)合,導(dǎo)致靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯成相關(guān)蛋白。一類miRNA往往能夠同時(shí)調(diào)控多個(gè)具有相同靶位點(diǎn)的靶基因,與此同時(shí),一個(gè)靶基因可能被多種miRNA進(jìn)行調(diào)控。果蠅中的剪切增強(qiáng)子E(spl)m4基因是miRNA的靶基因,該基因存在于Notch信號(hào)途徑末端,mi RNA通過調(diào)控E(spl)m4參與Notch信號(hào)途徑調(diào)控,調(diào)節(jié)果蠅的神經(jīng)發(fā)育。前期研究從家蠶中克隆得到了果蠅E(spl)m4的同源基因,并將其命名為BmEm4[Bombyx mori E(spl)m4],并獲得了效價(jià)較高的BmEm4多克隆抗體。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該基因的3’端未翻譯區(qū)存在多個(gè)潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)序列區(qū)(3個(gè)Brd box,1個(gè)GY box,2個(gè)K box等)。本課題研究了家蠶bmo-miR-79對(duì)BmEm4的調(diào)控作用,為研究家蠶miRNA對(duì)Notch信號(hào)通路的影響打下基礎(chǔ)。基于前期研究成果,本研究進(jìn)一步開展bmo-miR-79靶基因的雙熒光素酶驗(yàn)證。首先通過PCR方法將BmEm4基因正常的3’UTR及靶位點(diǎn)序列Brd box、K box突變后的3’UTR克隆至p IEx-1-Rluc-Luc載體上(實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的雙熒光素酶載體)。將該重組載體與體外合成的bmo-miR-79 mimics及Negative control共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞,雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照相比,重組載體與bmo-miR-79 mimics共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞后報(bào)告基因螢火蟲熒光素酶催化底物的發(fā)光值降低,與此同時(shí),由靶位點(diǎn)序列突變后的3’UTR構(gòu)建的重組載體與陰性對(duì)照及bmo-miR-79 mimics共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞的結(jié)果并無明顯差別。結(jié)果表明,BmEm4基因是bmo-miR-79的靶基因,且靶位點(diǎn)位于該基因的3’UTR的Brd box及K box區(qū)域。為了進(jìn)一步驗(yàn)證bmo-miR-79對(duì)靶基因BmEm4的調(diào)控作用,我們用不同濃度的bmo-miR-79 mimics轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞使其在細(xì)胞中上調(diào),并用Western Blotting的方法檢測了轉(zhuǎn)染后不同時(shí)段的BmEm4的表達(dá)譜。轉(zhuǎn)染不同濃度bmo-miR-79后BmEm4基因的翻譯表達(dá)水平均有下調(diào),高濃度bmo-miR-79轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中BmEm4蛋白下調(diào)顯著,且在72 h后抑制效果達(dá)到近50%。為了驗(yàn)證bmo-miR-79在家蠶發(fā)育時(shí)期對(duì)BmEm4基因的表達(dá)調(diào)控作用,我們開展了bmo-mi R-79和BmEm4基因在家蠶發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜研究。結(jié)果表明,家蠶各個(gè)發(fā)育時(shí)期BmEm4及bmo-miR-79的表達(dá)水平差異明顯各異,BmEm4蛋白的翻譯水平相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平來說受到不同程度的抑制,抑制程度由高到低依次為蛹、卵和蛾,研究結(jié)果進(jìn)一步證明家蠶bmo-miR-79在家蠶發(fā)育時(shí)期對(duì)BmEm4表達(dá)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,可能進(jìn)一步調(diào)控家蠶Notch信號(hào)通路。前期研究發(fā)現(xiàn)BmEm4基因在BmAGO2結(jié)合RNA中富集較多,是潛在的mi RNA靶基因。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)bmo-miR-79能與具有生物活性的BmAGO2蛋白互作,表明bmo-miR-79可通過和BmAGO2蛋白結(jié)合形成的miRISC復(fù)合物對(duì)BmEm4進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,與以往miRNA行使基因調(diào)控功能的過程依賴于AGO蛋白等組成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的研究結(jié)論相符。BmEm4基因是家蠶Notch信號(hào)通路家族成員之一,關(guān)于家蠶Notch信號(hào)通路的研究至今甚少。本研究以我國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)昆蟲和鱗翅目昆蟲模式生物家蠶為研究對(duì)象,開展miRNA對(duì)Notch相關(guān)基因的調(diào)控研究,對(duì)進(jìn)一步研究家蠶生長發(fā)育過程中miRNA的許多基因調(diào)控機(jī)理具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1212709