本文關鍵詞：家蠶bmo-miR-79對靶基因BmEm4表達調控的研究

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【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA,在生物體中起著至關重要的轉錄后調控作用。MiRNA通常是通過RISC復合物與靶基因mRNA的3’未翻譯區(qū)的靶位點序列互補結合,導致靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯成相關蛋白。一類miRNA往往能夠同時調控多個具有相同靶位點的靶基因,與此同時,一個靶基因可能被多種miRNA進行調控。果蠅中的剪切增強子E(spl)m4基因是miRNA的靶基因,該基因存在于Notch信號途徑末端,mi RNA通過調控E(spl)m4參與Notch信號途徑調控,調節(jié)果蠅的神經發(fā)育。前期研究從家蠶中克隆得到了果蠅E(spl)m4的同源基因,并將其命名為BmEm4[Bombyx mori E(spl)m4],并獲得了效價較高的BmEm4多克隆抗體。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),該基因的3’端未翻譯區(qū)存在多個潛在的miRNA結合位點序列區(qū)(3個Brd box,1個GY box,2個K box等)。本課題研究了家蠶bmo-miR-79對BmEm4的調控作用,為研究家蠶miRNA對Notch信號通路的影響打下基礎�；谇捌谘芯砍晒�,本研究進一步開展bmo-miR-79靶基因的雙熒光素酶驗證。首先通過PCR方法將BmEm4基因正常的3’UTR及靶位點序列Brd box、K box突變后的3’UTR克隆至p IEx-1-Rluc-Luc載體上(實驗室構建的雙熒光素酶載體)。將該重組載體與體外合成的bmo-miR-79 mimics及Negative control共轉染家蠶BmN細胞,雙熒光素酶報告基因法檢測結果顯示,與陰性對照相比,重組載體與bmo-miR-79 mimics共轉染家蠶細胞后報告基因螢火蟲熒光素酶催化底物的發(fā)光值降低,與此同時,由靶位點序列突變后的3’UTR構建的重組載體與陰性對照及bmo-miR-79 mimics共轉染家蠶BmN細胞的結果并無明顯差別。結果表明,BmEm4基因是bmo-miR-79的靶基因,且靶位點位于該基因的3’UTR的Brd box及K box區(qū)域。為了進一步驗證bmo-miR-79對靶基因BmEm4的調控作用,我們用不同濃度的bmo-miR-79 mimics轉染家蠶BmN細胞使其在細胞中上調,并用Western Blotting的方法檢測了轉染后不同時段的BmEm4的表達譜。轉染不同濃度bmo-miR-79后BmEm4基因的翻譯表達水平均有下調,高濃度bmo-miR-79轉染后細胞中BmEm4蛋白下調顯著,且在72 h后抑制效果達到近50%。為了驗證bmo-miR-79在家蠶發(fā)育時期對BmEm4基因的表達調控作用,我們開展了bmo-mi R-79和BmEm4基因在家蠶發(fā)育時期的表達譜研究。結果表明,家蠶各個發(fā)育時期BmEm4及bmo-miR-79的表達水平差異明顯各異,BmEm4蛋白的翻譯水平相對轉錄水平來說受到不同程度的抑制,抑制程度由高到低依次為蛹、卵和蛾,研究結果進一步證明家蠶bmo-miR-79在家蠶發(fā)育時期對BmEm4表達進行了轉錄后水平的調控,可能進一步調控家蠶Notch信號通路。前期研究發(fā)現(xiàn)BmEm4基因在BmAGO2結合RNA中富集較多,是潛在的mi RNA靶基因。凝膠阻滯實驗進一步證實bmo-miR-79能與具有生物活性的BmAGO2蛋白互作,表明bmo-miR-79可通過和BmAGO2蛋白結合形成的miRISC復合物對BmEm4進行轉錄后水平的調控,與以往miRNA行使基因調控功能的過程依賴于AGO蛋白等組成的RNA誘導沉默復合體的研究結論相符。BmEm4基因是家蠶Notch信號通路家族成員之一,關于家蠶Notch信號通路的研究至今甚少。本研究以我國重要的農業(yè)經濟昆蟲和鱗翅目昆蟲模式生物家蠶為研究對象,開展miRNA對Notch相關基因的調控研究,對進一步研究家蠶生長發(fā)育過程中miRNA的許多基因調控機理具有重要意義。
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

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本文編號：1212709