本文關鍵詞：光皮樺實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

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【摘要】：【目的】利用定量PCR和表達分析軟件研究候選內(nèi)參基因在光皮樺不同組織中的表達穩(wěn)定性,并通過目的基因的表達分析驗證其可靠性,以獲得可用于光皮樺定量PCR的穩(wěn)定內(nèi)參基因�！痉椒ā窟x取16個常用的看家基因作為候選內(nèi)參基因,設計引物,通過普通PCR、溶解曲線及瓊脂糖凝膠電泳驗證引物的特異性;通過實時熒光定量PCR及軟件ge Norm、Norm Finder和Best Keeper分析候選內(nèi)參基因在光皮樺16個不同組織中的表達穩(wěn)定性,根據(jù)分析結果篩選出最佳的內(nèi)參基因和組合,并進一步通過2個目的基因CSLD和KOR對內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行驗證�！窘Y果】PCR和電泳結果顯示,候選內(nèi)參基因PCR目的片段條帶清晰單一,熔解曲線也呈現(xiàn)明顯的單一峰,表明這些引物的特異性良好。利用特異引物,對這些候選基因在16個不同組織的表達進行分析,發(fā)現(xiàn)除了18S,其他基因的Ct值均集中在25~30之間,表明內(nèi)參基因在不同組織中表達較穩(wěn)定,它們之間的表達水平差異不明顯。Norm Finder和Best Keeper分析結果均表明基因EF1α的穩(wěn)定性最好,ge Norm計算得出最穩(wěn)定的是TATA,而UBi-lp在所有候選內(nèi)參基因中表達最不穩(wěn)定。進一步選取3個穩(wěn)定表達候選基因(EF1α,TATA和UBi4)及穩(wěn)定性較差的UBi-lp作為內(nèi)參基因,對2個目的基因CSLD和KOR在不同組織中的相對表達進行分析,結果表明這2個目的基因相對于3個穩(wěn)定的內(nèi)參基因顯示出一致的相對表達量,而不穩(wěn)定的內(nèi)參基因UBi-lp并沒有對表達數(shù)據(jù)進行有效的標準化,結果存在明顯偏差�！窘Y論】通過實時熒光定量PCR及綜合3種軟件分析的結果,在光皮樺不同的組織中,EF1α,TATA和UBi4內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性高,對這3個基因進行驗證并明確其作為熒光實時定量PCR內(nèi)參的可靠性。因此,EF1α,TATA和UBi4可作為研究基因在光皮樺不同組織器官中表達的穩(wěn)定內(nèi)參。
【作者單位】： 浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地;
【基金】：國家自然科學基金項目(31100494) 浙江省竹木農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(2012C12908-8)
【分類號】：S792.15
【正文快照】： 實時熒光定量PCR是在普通PCR技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術,因其定量準確、特異性強、靈敏度高及高通量的優(yōu)點被廣泛應用于基因表達分析(Nolan et al.,2006;Schmid et al.,2003;Wong et al.,2005)。然而,由于受到RNA提取質(zhì)量、逆轉(zhuǎn)錄效率等因素的影響,目的基因表達結果的

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