FU和MG132選擇性調(diào)控NKG2D配體表達(dá)及其機(jī)制初步研究
本文關(guān)鍵詞：rd29A啟動(dòng)子的克隆及提高煙草抗逆性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》 2010年
5-FU和MG132選擇性調(diào)控NKG2D配體表達(dá)及其機(jī)制初步研究
羅丹
【摘要】： NK細(xì)胞是天然免疫的主要承擔(dān)者,在腫瘤免疫、抗病毒感染及清除非己細(xì)胞中發(fā)揮重要作用【1-4】。與T細(xì)胞不同的是,NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用不受腫瘤細(xì)胞的MHC-Ⅰ類分子的限制,其細(xì)胞活性的發(fā)揮是其表達(dá)的各種受體分子與相應(yīng)配體相互作用的結(jié)果。 NKG2D (NK group 2, member D)為NK細(xì)胞表面活化性受體,屬C型凝集素超家族成員。NKG2D可以廣泛地表達(dá)于多種免疫細(xì)胞【5,6】,如所有NK細(xì)胞表面以及部分NKT細(xì)胞、部分T細(xì)胞【7】。NKG2D的配體為MHC-I類相關(guān)分子(MHC class I-related molecules, MICs),包括MICA、MICB和ULBP1-5(病毒UL16結(jié)合蛋白)等【8】。MICA/B和ULBP1~3可被金屬蛋白酶作用而從細(xì)胞表面脫落【9】。MICs為“誘導(dǎo)型”細(xì)胞表面抗原【10,11】,近年的研究【12】發(fā)現(xiàn)許多因素,如細(xì)胞應(yīng)激、熱休克、感染、DNA損傷和轉(zhuǎn)化等均可上調(diào)它們的表達(dá),病毒miRNA、基質(zhì)金屬蛋白酶等可影響NKG2D配體的表達(dá)【13-17】。 研究表明,由于腫瘤細(xì)胞的MHC-I類分子丟失或變異,使得特異性MHC限制性的細(xì)胞毒T細(xì)胞不能發(fā)揮作用。在這種情況下,識(shí)別非MHC-I類分子的NKG2D在介導(dǎo)NK細(xì)胞識(shí)別和溶解腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用【18,19】。NKG2D通過與靶細(xì)胞表面誘導(dǎo)產(chǎn)生的相應(yīng)配體結(jié)合,然后結(jié)合轉(zhuǎn)接蛋白向NK細(xì)胞傳遞活化信號(hào),使NK細(xì)胞獲得攻擊靶細(xì)胞的能力【20】。另外還為CD8 + T細(xì)胞提供必要的協(xié)同刺激信號(hào),因此在很大程度上NKG2D途徑的活化決定了機(jī)體的抗腫瘤細(xì)胞免疫水平。 文獻(xiàn)報(bào)道DNA損傷反應(yīng)可以通過誘導(dǎo)NKG2D配體的上調(diào)來增加腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的敏感性【21-24】,因此激活DNA損傷反應(yīng)的藥物/治療方法(如放療、化療)和NK細(xì)胞治療聯(lián)合應(yīng)用,有可能減少藥物的副作用,提高腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性,提高抗腫瘤效果。 目前,化療聯(lián)合基于NK細(xì)胞的免疫治療在臨床上應(yīng)用廣泛,但化療對(duì)NK細(xì)胞抗腫瘤活性的調(diào)節(jié)機(jī)制,尤其是對(duì)NKG2D介導(dǎo)的殺傷機(jī)制是如何調(diào)節(jié)的還不甚清楚。為什么同一個(gè)NKG2D受體在細(xì)胞上存在多種不同的配體?它們的作用有何差異?表達(dá)調(diào)控上有何不同?不同的化療藥物所造成的損傷不同,其調(diào)控NKG2D配體表達(dá)的通路差異是什么?雖然NKG2D配體編碼區(qū)有一定保守性,但其5’非翻譯區(qū)同源性很低,提示不同刺激或病變對(duì)不同的NKG2D配體的表達(dá)調(diào)控可能是特異的。 因此,本研究以肺腺癌A549細(xì)胞系為模型,研究不同作用機(jī)制的抗代謝抗腫瘤藥5-FU和蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)A549細(xì)胞的NKG2D配體表達(dá)及對(duì)NK細(xì)胞殺傷敏感性的影響,并探討其可能的調(diào)控機(jī)制。 目的:研究5-FU和MG132對(duì)A549細(xì)胞NKG2D配體表達(dá)的調(diào)控及其機(jī)制。 方法:采用PCR方法,以A549細(xì)胞的全基因組為模板,擴(kuò)增人NKG2D配體MICA/B的啟動(dòng)子及其5個(gè)截短體基因,并亞克隆入pGL3-Basic報(bào)告基因載體,轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后運(yùn)用雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行啟動(dòng)子活性分析。用MTT法檢測了不同濃度5-FU和MG132對(duì)A549細(xì)胞的抑制率;測定了300μM 5-FU、10μM MG132處理對(duì)MICA/B啟動(dòng)子活性的影響。采用熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測5-FU和MG132對(duì)NKG2D配體在mRNA、細(xì)胞表面蛋白水平上的表達(dá)變化;用彗星法觀察5-FU和MG132處理A549后DNA的損傷情況;Western blot檢測DNA損傷反應(yīng)通路中信號(hào)分子Chk1、Chk2蛋白磷酸化;并觀察了DNA損傷反應(yīng)通路分子抑制劑對(duì)5-FU和MG132誘導(dǎo)NKG2D配體表達(dá)作用的影響。 結(jié)果:克隆了人MICA、MICB的啟動(dòng)子及其五個(gè)截短體基因并測定了啟動(dòng)子基礎(chǔ)活性。5-FU可分別上調(diào)MICA/B啟動(dòng)子相對(duì)活性1.48和1.87倍, MG132可上調(diào)MICB啟動(dòng)子相對(duì)活性1.77倍。5-FU可提高M(jìn)ICB和ULBP2在mRNA水平的表達(dá),分別是對(duì)照的1.76和3.28倍,而在細(xì)胞表面蛋白水平MICB蛋白表達(dá)水平?jīng)]變化,ULBP2表達(dá)提高了16.05%;MG132可提高M(jìn)ICB、ULBP1、ULBP3在mRNA水平的表達(dá),分別是對(duì)照的10.62、11.09和7.25倍,而細(xì)胞表面蛋白只有MICB、ULBP1表達(dá)分別提高了68.18%、23.65%。NK殺傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5-FU和MG132可提高NK細(xì)胞對(duì)A549細(xì)胞的殺傷率,NK對(duì)A549的殺傷作用可部分被NKG2D抗體、ULBP2抗體、MICB和ULBP1抗體抑制。5-FU和MG132處理可使A549細(xì)胞DNA發(fā)生損傷,彗星法(堿性裂解法)可觀察到明顯的拖尾現(xiàn)象,而且5-FU和MG132可分別使Chk1、Chk2發(fā)生磷酸化。使用ATM激酶抑制劑KU55933、Chk1抑制劑SB218078和PI3激酶抑制劑Wortmannin均可抑制5-FU和MG132引起的細(xì)胞表面ULBP2和MICB的表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論:以上結(jié)果表明5-FU和MG132分別選擇性上調(diào)了A549細(xì)胞表面ULBP2和MICB的表達(dá),并增強(qiáng)了A549細(xì)胞對(duì)NKG2D及其相應(yīng)配體介導(dǎo)的NK殺傷敏感性。5-FU對(duì)ULBP2表達(dá)的調(diào)節(jié)可能與DNA損傷反應(yīng)通路中Chk1的磷酸化水平上升有關(guān),MG132對(duì)MICB表達(dá)的調(diào)節(jié)可能與Chk2的磷酸化水平增加有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R730.3
【目錄】：
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【參考文獻(xiàn)】
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7 周志剛;王振豫;王軍委;;放射與5-Fu粒子聯(lián)合植入治療胰腺癌[A];中國(第七屆)腫瘤微創(chuàng)治療學(xué)術(shù)大會(huì)暨世界影像導(dǎo)引下腫瘤微創(chuàng)治療學(xué)會(huì)成立籌備大會(huì)論文匯編[C];2011年
8 楊慧;宋于剛;;沉默PI3K p85α表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞5-FU敏感性的影響及其的相關(guān)機(jī)制的研究[A];第二十二屆全國中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會(huì)議暨消化疾病診治進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2010年
9 張振;沃雁;章一新;毛小慧;錢云良;王丹茹;賀蓉;崔大祥;;納米級(jí)5-FU變形脂質(zhì)體的體外透瘢痕實(shí)驗(yàn)[A];第七屆中國醫(yī)師協(xié)會(huì)美容與整形醫(yī)師大會(huì)論文集[C];2010年
10 李崇佼;蘭曉莉;張永學(xué);;應(yīng)用~(18)F-FDG評(píng)價(jià)結(jié)腸癌對(duì)FU治療后早期反應(yīng)的基礎(chǔ)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國核醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2011年
中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條
1 王娟霞;有機(jī)硅季銨鹽聯(lián)合5-FU對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響[D];蘭州大學(xué);2013年
2 胡斌;Id-1 siRNA增強(qiáng)大腸癌SW480細(xì)胞對(duì)5-FU的化療敏感性[D];中南大學(xué);2010年
3 楊宇;胰腺癌5-氟尿嘧啶（5-FU）耐藥相關(guān)蛋白篩查及胰腺癌候選免疫原性膜抗原SLP-2和Prohibitin分子生物學(xué)功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年
4 馬克龍;DNA甲基化調(diào)控的microRNA所介導(dǎo)的腫瘤化療敏感性：肝癌5-FU化療敏感性之范例[D];復(fù)旦大學(xué);2011年
5 林桂渺;Egr-hTERTC27聯(lián)合5-FU治療鼻咽癌及TCF3抑制小鼠胚胎癌生長的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2012年
6 張為家;TGFβ2經(jīng)Snail介導(dǎo)的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在乳腺癌5-FU耐藥中的作用及機(jī)制[D];中南大學(xué);2012年
7 楊景文;5-Fu誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系及機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年
中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條
1 張士璽;針撥聯(lián)合5-FU結(jié)膜下注射治療失敗濾過泡的臨床研究[D];山東大學(xué);2011年
2 武雙雙;雷替曲塞聯(lián)合5-FU用于治療結(jié)腸癌的體外研究[D];吉林大學(xué);2012年
3 賀偉;5-FU對(duì)人體膽管瘢痕成纖維細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2012年
4 林海;微波消融聯(lián)合5-FU對(duì)小鼠結(jié)腸癌移植瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2011年
5 楊占彪;FU公司技術(shù)創(chuàng)新管理的研究[D];西北大學(xué);2012年
6 曾思敏;多不飽和脂肪酸及其聯(lián)合5-FU影響胃癌細(xì)胞生長的細(xì)胞生物學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2014年
7 張苗苗;多西他賽聯(lián)合奧沙利鉑、5-Fu方案治療晚期胃癌的療效分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年
8 王建才;結(jié)直腸癌術(shù)中腹腔植入5-FU緩釋劑的臨床研究[D];中南大學(xué);2013年
9 續(xù)婷婷;瘤內(nèi)注射貝伐單抗聯(lián)合5-FU治療結(jié)直腸癌實(shí)驗(yàn)的相關(guān)探討[D];中南大學(xué);2013年
10 徐秀利;5-FU聯(lián)合雷公藤甲素治療胰腺癌作用的體外實(shí)驗(yàn)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年
本文關(guān)鍵詞：rd29A啟動(dòng)子的克隆及提高煙草抗逆性的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
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