本文關(guān)鍵詞：利用基因工程小鼠和GT1-7細(xì)胞系研究miRNA對(duì)性發(fā)育的影響

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【摘要】：背景：MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度大約為22nt的非編碼小RNAs,它能通過靶向結(jié)合mRNA3'端非編碼區(qū)(3'UTR)調(diào)控大量生物學(xué)過程包括細(xì)胞增殖與凋亡、神經(jīng)元分化、腫瘤產(chǎn)生以及個(gè)體發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究通過比較C3H/HeJ和C57BL/6兩種近交系雌鼠間陰門開啟時(shí)間的差異定位到了與性發(fā)育相關(guān)的基因：miR-505。此外,有研究表明miR-29基因家族成員中的miR-29a在哺乳動(dòng)物大腦中高度表達(dá),并且隨著幼年個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育,其在大腦中的表達(dá)量有著明顯的波動(dòng),表明miR-29a可能在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用從而調(diào)控個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育�；蚯贸夹g(shù)是目前研究miRNA生物學(xué)功能的主要反向遺傳學(xué)方法之一。而CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)作為一種來源于細(xì)菌和古細(xì)菌免疫系統(tǒng)的新型基因編輯工具,能夠有效地引發(fā)靶基因突變進(jìn)而導(dǎo)致基因功能喪失。目的：本研究嘗試?yán)胢iR-505基因敲除小鼠,研究miR-505敲除對(duì)雌鼠性發(fā)育和生殖力的影響；利用CRISPR-Cas9技術(shù)在GT1-7細(xì)胞中對(duì)miR-29a進(jìn)行基因敲除,檢測(cè)miR-29a基因敲除GT1-7細(xì)胞的表型變化,探索miRNAs與性發(fā)育之間的聯(lián)系。方法：在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面,通過sgRNA/Cas9進(jìn)行胚胎注射獲得miR-505基因修飾小鼠,通過與野生型C57BL/6小鼠三代回交得到穩(wěn)定遺傳的基因修飾小鼠。通過進(jìn)一步自交,獲得三種基因型的子代,最后比較不同基因型雌鼠miR-505表達(dá)量情況、性發(fā)育和生殖力表型。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面,構(gòu)建Cas9基因穩(wěn)轉(zhuǎn)的GT1-7細(xì)胞,并構(gòu)建sgRNA29a-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述GT1-7細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀富集陽(yáng)性細(xì)胞和分選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。最后對(duì)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞分別進(jìn)行miR-29a表達(dá)量檢測(cè)、表型分析和靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證。結(jié)果：在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面,胚胎注射獲得了16只miR-505基因工程小鼠,其中有兩只基因工程小鼠分別具有17bp和23bp的堿基缺失。熒光定量PCR結(jié)果顯示,大片段缺失的基因工程小鼠的miR-505表達(dá)量有了顯著的下降。雖然不同基因型雌鼠間miR-505表達(dá)量的顯著差異沒有引起性發(fā)育和生殖能力的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性變化,但是總體平均值顯示雌鼠miR-505表達(dá)的缺失具有使陰門開啟時(shí)間提前和增強(qiáng)部分生殖指標(biāo)的趨勢(shì)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面,成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的GT1-7細(xì)胞模型,并利用該細(xì)胞模型完成了多種基因編輯。此外,流式富集后的表達(dá)綠色熒光蛋白陽(yáng)性GT1-7細(xì)胞,其miR-29a突變率和表達(dá)量都發(fā)生了明顯的變化。通過流式細(xì)胞儀獲得了一個(gè)miR-29a基因修飾GT1-7單克隆細(xì)胞,它在miR-29a基因區(qū)段有2 bp的堿基缺失。此外,miR-29a的表達(dá)量下降程度較富集細(xì)胞更高,而且miR-29a表達(dá)量的顯著下降導(dǎo)致了GT1-7細(xì)胞生長(zhǎng)速率的減緩和表型的變化。靶基因驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn),DCX基因受到了miR-29a表達(dá)量變化的影響。結(jié)論：利用CRIPSR-Cas9系統(tǒng)對(duì)miRNAs基因進(jìn)行編輯能夠有效降低miRNAs的表達(dá)量,即使CRISPR-Cas9系統(tǒng)造成的堿基缺失主要發(fā)生在miRNAs的加工區(qū)域。而Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)GT1-7細(xì)胞顯著提高了基因編輯效率,并有利于后續(xù)利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行富集細(xì)胞。通過構(gòu)建miR-505基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn),miR-505敲除對(duì)雌鼠性發(fā)育和生殖能力沒有產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的影響,但是總體平均值顯示miR-505敲除雌鼠陰門開啟的時(shí)間和部分生殖指標(biāo)具有一致性的變化趨勢(shì)。相比之下,miR-29a在GT1-7細(xì)胞中具有比較明顯的生物學(xué)功能,并且可能通過調(diào)控DCX基因來實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1185022