本文關(guān)鍵詞：阿霉素合成途徑關(guān)鍵酶基因的異源表達(dá)

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【摘要】：阿霉素具有強(qiáng)烈的生物化學(xué)效應(yīng),是臨床上的一種重要抗腫瘤藥物。阿霉素可由Streptomyces peucetius ATCC 27952天然微量合成；傳統(tǒng)的化學(xué)法大規(guī)模合成阿霉素因其成本高、污染環(huán)境等缺點(diǎn)而制約了該藥的生產(chǎn)。阿霉素高產(chǎn)菌株的篩選一直是該藥生物合成法的研究熱點(diǎn)。在這些研究中,基因工程則表現(xiàn)出良好前景,特別是近年來合成生物學(xué)的快速發(fā)展。本研究則指向阿霉素關(guān)鍵酶基因的異源表達(dá),以期實(shí)現(xiàn)阿霉素代謝通路的異源化構(gòu)建,進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)阿霉素的異源菌株的從頭合成。具體內(nèi)容包括：1、針對阿霉素生物途徑長、涉及關(guān)鍵酶基因繁多,以商業(yè)化的pET-28a載體為基礎(chǔ),將該載體的T7啟動(dòng)子前的Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)失活,并在其后面加一個(gè)Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)；在T7終止子后加一個(gè)SpeⅠ酶切位點(diǎn)。構(gòu)建出多基因串聯(lián)共表達(dá)載體,并命名為pBD,方便后續(xù)多基因的共表達(dá)；2、利用基因組提取試劑盒提取了S. peucetius基因組,用PCR克隆技術(shù)克隆并構(gòu)建阿霉素合成關(guān)鍵酶基因的T載體,然后構(gòu)建表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株,實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。克隆了阿霉素天然合成途徑中負(fù)責(zé)成鏈、成環(huán)以及成環(huán)后糖基化及其修飾基因共16個(gè),依次為dpsA、dpsB、dpsC、dpsD、dpsE、dpsF、dpsG、 dnrC、dnrD、dnrE、dnrF、doxA、dnrK、dnrP,表達(dá)了成鏈過程中關(guān)鍵酶基因依次為dpsA、dpsB、dpsC、dpsD、dpsF、 dpsG、dnrG/dpsY,其中dpsCA、dpsE、dpsF、dpsY、dnrG正常表達(dá)。3、考慮到外源基因過表達(dá)往往降低工程菌的生物量,而生物量的積累往往會(huì)促進(jìn)產(chǎn)量的提高：而大腸桿菌與克雷伯氏菌(Klebsiella. AA 405)遺傳背景非常相似,研究了Klebsiella. AA 405自身生長基因的過表達(dá)對甘油代謝途徑中1,3-丙二醇、2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與攜帶空質(zhì)粒重組菌相比,過表達(dá)編碼核糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)酶的rbsC基因工程菌可使其生物量和甘油轉(zhuǎn)化率分別提高16.08%和24.69%,而1,3-丙二醇和2,3-丁二醇產(chǎn)量則分別提高了39.59%和19.79%；過表達(dá)編碼tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因cca則可使其生物量和甘油轉(zhuǎn)化率分別提高7.17%和19.16%,而1,3-丙二醇和2,3-丁二醇產(chǎn)量則分別提高了36.24%和13.39%。結(jié)果表明通過刺激細(xì)菌的生長可促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的積累。
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TQ460.1;Q78

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本文編號(hào)：1176040