本文關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型ORF6基因功能的初步研究

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【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染豬可以引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎和腎病綜合征及豬壞死性和增生性肺炎等多種疾病。PCV2廣泛流行于全世界范圍內(nèi),給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,然而其致病機(jī)制尚不清楚。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測,PCV2含有11個ORFs(ORF1-11)。目前,PCV2被驗(yàn)證鑒定的蛋白有五個,包括ORF1-5。本研究鑒定了一個新的蛋白,ORF6。ORF6基因全長90bp,位于PCV2的負(fù)鏈DNA1611-1522bp,編碼30aa,預(yù)測分子量為2.8k D。本研究主要鑒定了PCV2 ORF6蛋白,并對其生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究,具體的研究內(nèi)容有:1.PCV2 ORF6原核表達(dá)及多克隆抗體的制備通過設(shè)計(jì)引物連入一個柔性多肽(Gly4Ser)2,利用PCR,將2個ORF6基因片段串聯(lián)在一起,再插入p GEX-KG原核表達(dá)載體中,構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒p GEX-2ORF6。對其進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá),獲得融合表達(dá)蛋白GST-2ORF6,且該蛋白是以可溶形式存在的。進(jìn)一步純化蛋白,免疫2只兔子,獲得兔高免血清。高免血清濃度分別為1.59mg/m L和2.38mg/m L,效價(jià)分別為1:25×1000和1:27×1000,抗體1:1000稀釋可檢測到500pg抗原。2.PCV2 ORF6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)驗(yàn)證ORF6基因完全包含于ORF2中,為驗(yàn)證ORF6 m RNA的轉(zhuǎn)錄,本研究利用熒光定量PCR檢測了PCV2感染PK-15細(xì)胞后的ORF2+6與ORF2的m RNA差異。結(jié)果病毒感染細(xì)胞后不同時(shí)間ORF2+6 m RNA均明顯多于ORF2 m RNA,不同時(shí)間ORF2+6約是ORF2的2.1~3倍。驗(yàn)證了PCV2 ORF6 m RNA的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步將PCV2野毒接種PK-15細(xì)胞,利用制備的ORF6多抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測,結(jié)果觀察到PCV2感染細(xì)胞后有特異性綠色熒光,表明PCV2感染細(xì)胞內(nèi)存在ORF6蛋白。驗(yàn)證了ORF6蛋白的表達(dá)。通過ORF6基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)檢測,證實(shí)了PCV2 ORF6編碼蛋白。3.PCV2 ORF6的細(xì)胞定位及真核表達(dá)為研究ORF6蛋白的亞細(xì)胞定位,我們將PCV2野毒接種PK-15細(xì)胞,利用ORF6多抗進(jìn)行IFA檢測PCV2 ORF6在細(xì)胞內(nèi)的分布情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF6主要分布于細(xì)胞漿內(nèi)。本研究構(gòu)建了ORF6基因的串聯(lián)雙拷貝的真核表達(dá)質(zhì)粒p CAGGS-2ORF6。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T,通過Western blot檢測驗(yàn)證了ORF6在體外獲得表達(dá)。4.感染性克隆的構(gòu)建及體外病毒拯救以PCV2全基因組為模板設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增含有特定酶切位點(diǎn)HindⅢ、SacⅡ的PCV2全長基因片段和含2個SacⅡ酶切位點(diǎn)的PCV2全長基因片段,連入p Bluescript SK載體,構(gòu)建了PCV2雙拷貝感染性克隆(野生型PSK-2PCV2)。同時(shí),為了構(gòu)建ORF6表達(dá)缺失的突變株,通過PCR,將ORF6的起始密碼子ATG進(jìn)行突變?yōu)锳CG,使其表達(dá)沉默,同時(shí)不影響ORF2的蛋白編碼序列。再利用與構(gòu)建野生型PSK-2PCV2同樣方法構(gòu)建ORF6表達(dá)缺失雙拷貝感染性克隆(突變型PSK-2PCV2)。將野生型PSK-2PCV2和突變型PSK-2PCV2感染性克隆轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后,盲傳3代。通過熒光定量PCR檢測、ORF2 m RNA轉(zhuǎn)錄檢測及IFA試驗(yàn)證實(shí)病毒拯救成功,能在體外增殖傳代。利用熒光定量PCR對不同病毒的體外增殖情況進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF6缺失后病毒仍能進(jìn)行復(fù)制,進(jìn)一步利用一步法增殖曲線發(fā)現(xiàn)ORF6缺失后病毒的增殖滴度明顯下降。證實(shí)ORF6不是病毒復(fù)制所必需的基因,但ORF6影響病毒在體外的增殖滴度。5.PCV2 ORF6的生物學(xué)功能本研究利用凋亡檢測試劑盒對單獨(dú)表達(dá)ORF6及野生型和突變型病毒感染細(xì)胞后的caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,單獨(dú)表達(dá)PCV2ORF6不能激活caspase-3、caspase-8、caspase-9。但突變毒株較野生毒株的caspase-3蛋白活性顯著升高,caspase-8蛋白活性有所下降,caspase-9的蛋白活性無顯著差異。ORF6在PCV2誘導(dǎo)凋亡中的作用還需進(jìn)一步研究。將ORF6真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,利用熒光定量PCR檢測IFN-β、TNF-α、RANTES、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-13等細(xì)胞因子的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)表達(dá)ORF6能促使IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13細(xì)胞因子表達(dá)量顯著升高。同時(shí)將野生重組型(w-2PCV2)、突變型(m-2PCV2)病毒分別接種PK-15細(xì)胞,熒光定量PCR檢測上述細(xì)胞因子表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)ORF6缺失導(dǎo)致病毒感染細(xì)胞后IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-13等細(xì)胞因子表達(dá)量顯著下降。綜合ORF6表達(dá)與病毒感染分析,證實(shí)ORF6蛋白能激活I(lǐng)FN-β、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13細(xì)胞因子的表達(dá)。6.PCV2 ORF6對IL-10的影響IL-10參與病毒感染宿主誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)及免疫抑制反應(yīng),為探究ORF6引起IL-10表達(dá)量上升的信號通路,利用不同的信號通路抑制劑對其進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)蛋白激酶PKC抑制劑GF-109203X能顯著下調(diào)ORF6激活I(lǐng)L-10的表達(dá)量。進(jìn)一步利用不同濃度的GF-109203X抑制劑處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)ORF6誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)量與抑制劑濃度呈反比關(guān)系,即抑制劑濃度越高,其ORF6誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)量越低。表明ORF6誘導(dǎo)IL-10表達(dá)是通過蛋白激酶C通路激活的。總之,本研究新鑒定了PCV2 ORF6蛋白,其表達(dá)定位于細(xì)胞漿內(nèi)。ORF6不是病毒復(fù)制所必需的基因,但ORF6影響病毒在體外的增殖滴度。ORF6蛋白能激活I(lǐng)FN-β、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13細(xì)胞因子的表達(dá),且通過蛋白激酶C通路激活I(lǐng)L-10表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1140675