本文關(guān)鍵詞：燈盞花查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆、轉(zhuǎn)化及MYB調(diào)控基因的克隆

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【摘要】：燈盞花,又名短亭飛蓬(Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.),為菊科飛蓬屬植物的全草,主要的有效藥用成分為類黃酮化合物。類黃酮是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一類重要次生代謝物,其特殊的生理活性和多元性的生物功能使它成為當(dāng)下植物學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)、植物生理學(xué)、植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)等學(xué)科的研究重點(diǎn)、熱點(diǎn)。黃酮類是由植物體內(nèi)的類黃酮代謝途徑及其衍生的各代謝通道所合成。參與該合成途徑有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控元件,不僅在結(jié)構(gòu)上具有較強(qiáng)的保守性,同時(shí)在功能上也具有保守性。因此,利用生物信息學(xué)手段,基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)模式植物的研究數(shù)據(jù),可快速、較為準(zhǔn)確的獲得某一植物中與類黃酮代謝途徑的相關(guān)結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控元件的相關(guān)信息。在獲得這些信息的基礎(chǔ)上,通過基因克隆、轉(zhuǎn)基因以及表現(xiàn)測(cè)定,就能較為準(zhǔn)確的判定及研究某一種植物中,參與類黃酮生物合成途徑的關(guān)鍵基因的結(jié)構(gòu)、功能及其與環(huán)境的互作機(jī)制。燈盞花查爾酮異構(gòu)酶(CHI)是黃酮類化合物代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,而MYB轉(zhuǎn)錄因子是參與合成代謝途徑調(diào)控的重要因子。本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析篩選出一條CHI unigene和一條MYB unigene,利用RACE技術(shù)從燈盞花中克隆獲得CHI和MYB全長(zhǎng)基因。在此基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)對(duì)其結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了分析,并以PBI121-EGFP為基礎(chǔ)載體,構(gòu)建了CHI和MYB基因與GFP形成融合蛋白的表達(dá)載體。通過根癌農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因方法將EGFP-CHI重組基因整合到燈盞花基因組中,同時(shí)建立燈盞花的遺傳轉(zhuǎn)化體系的基本方法。本研究對(duì)于從整體水平認(rèn)識(shí)燈盞花類黃酮合成關(guān)鍵基因的結(jié)構(gòu)與功能,以及通過分子手段調(diào)控?zé)舯K花黃酮類物質(zhì)生物合成具有深遠(yuǎn)意義。本研究獲得的成果如下:1.CHI基因、MYB基因的克隆及生物信息學(xué)分析通過RACE末端擴(kuò)增法克隆得到了燈盞花CHI全長(zhǎng)基因717 bp,MYB全長(zhǎng)基因780 bp,分別編碼238個(gè)氨基酸和260個(gè)氨基酸。本研究對(duì)燈盞花CHI基因與MYB基因的同源性和進(jìn)化發(fā)育進(jìn)行分析,結(jié)果表明該燈盞花CHI基因功能與查爾酮異構(gòu)酶活性和類黃酮生物合成密切相關(guān)。MYB蛋白N端保守結(jié)構(gòu)域?yàn)閇W]-x(20)-[W]-x(20)[W]-x(32)[W]-x(19)-[W],屬于R2R3-MYB家族,其功能與類黃酮合成的結(jié)構(gòu)基因活性和類黃酮生物合成途徑調(diào)控有關(guān)。2.CHI基因和MYB基因的重組載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化將CHI和MYB基因與PBI121-EGFP載體連接構(gòu)建重組載體。通過電擊法將兩個(gè)基因的重組載體分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞中。3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的燈盞花遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建利用不同濃度卡那霉素(Kan)和頭孢霉素(Cef)處理燈盞花葉片組織,研究燈盞花葉片對(duì)兩種抗生素的敏感性。經(jīng)研究選擇Kan 5 mg/L和Cef 200mg/L為篩選標(biāo)記濃度和農(nóng)桿菌抑制劑濃度。利用根癌農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將EGFP-CHI融合重組基因整合到燈盞花中,經(jīng)過Kan 5 mg/L+Cef 200mg/L的抗性培養(yǎng)基篩選培養(yǎng),得到轉(zhuǎn)化后的冠癭瘤狀組織。
【關(guān)鍵詞】：燈盞花 類黃酮生物合成 CHI MYB 植物遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：云南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S567.239
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第1章 引言11-20
• 1.1 燈盞花簡(jiǎn)介11
• 1.2 類黃酮化合物的研究11-12
• 1.2.1 類黃酮的概念11
• 1.2.2 類黃酮的功能11-12
• 1.3 燈盞花中類黃酮合成的可能途徑12-13
• 1.4 類黃酮合成路徑中的關(guān)鍵基因13-17
• 1.4.1 查爾酮異構(gòu)酶（CHI）基因14
• 1.4.2 MYB類轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因14-17
• 1.4.2.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的概念14-15
• 1.4.2.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)及其調(diào)控機(jī)制15
• 1.4.2.3 轉(zhuǎn)錄因子R2R3-MYB15-17
• 1.5 植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究17-19
• 1.5.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化法17
• 1.5.2 影響遺傳轉(zhuǎn)化的因素17-19
• 1.6 研究意義及內(nèi)容19-20
• 第2章 燈盞花CHI和MYB基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究20-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)方法20-21
• 2.1.1 CHI unigene的篩選20-21
• 2.1.2 MYB unigene的篩選21
• 2.2 結(jié)果21-22
• 2.2.1 CHI unigene的確定21
• 2.2.2 MYB unigene的確定21-22
• 2.3 小結(jié)22-23
• 附圖23-24
• 第3章 燈盞花CHI和MYB基因的克隆24-53
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 3.1.1 植物材料24
• 3.1.2 質(zhì)粒和菌株24
• 3.1.3 試劑和儀器24-25
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法25-35
• 3.2.1 燈盞花葉片總RNA提取25-27
• 3.2.2 CHI和MYB基因的克隆27-33
• 3.2.2.1 CHI和MYB unigene的驗(yàn)證27
• 3.2.2.2 CHI和MYB基因 5'末端克隆27-30
• 3.2.2.3 CHI和MYB基因 3'末端克隆30-31
• 3.2.2.4 CHI和MYB基因的全長(zhǎng)拼接31-32
• 3.2.2.5 pMD18-T載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化32-33
• 3.2.2.6 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定33
• 3.2.3 生物信息學(xué)分析33-35
• 3.3 結(jié)果35-51
• 3.3.1 燈盞花總RNA提取35
• 3.3.2 CHI及MYB unigene的驗(yàn)證35
• 3.3.3 CHI及MYB的克隆及載體構(gòu)建35-36
• 3.3.4 燈盞花CHI及MYB的核酸序列信息分析36-41
• 3.3.5 燈盞花CHI蛋白序列信息分析41-45
• 3.3.6 燈盞花MYB蛋白序列信息分析45-51
• 3.3.6.1 燈盞花MYB與擬南芥At MYB比對(duì)分析45
• 3.3.6.2 燈盞花MYB蛋白的結(jié)構(gòu)特征45
• 3.3.6.3 燈盞花MYB蛋白的功能預(yù)測(cè)45-51
• 3.4 小結(jié)51-53
• 第4章 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及燈盞花的遺傳轉(zhuǎn)化53-72
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料53-55
• 4.1.1 植物材料53
• 4.1.2 質(zhì)粒和菌株53
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑53-55
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法55-64
• 4.2.1 重組載體的構(gòu)建55-61
• 4.2.1.1 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取58-59
• 4.2.1.2 目的片段的擴(kuò)增59-60
• 4.2.1.3 酶切反應(yīng)及連接轉(zhuǎn)化60-61
• 4.2.2 重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV310161-62
• 4.2.2.1 農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備61
• 4.2.2.2 重組載體的電擊轉(zhuǎn)化61-62
• 4.2.2.3 重組載體的鑒定62
• 4.2.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的燈盞花遺傳轉(zhuǎn)化62-64
• 4.2.3.1 燈盞花無菌苗的獲得62
• 4.2.3.2 燈盞花對(duì)Kan的敏感性62-63
• 4.2.3.3 燈盞花對(duì)Cef的敏感性63
• 4.2.3.4 農(nóng)桿菌GV3101的培養(yǎng)63-64
• 4.2.3.5 燈盞花葉盤浸染及共培養(yǎng)64
• 4.2.3.6 篩選培養(yǎng)64
• 4.3 結(jié)果及分析64-71
• 4.3.1 重組載體的構(gòu)建及電擊轉(zhuǎn)化64-67
• 4.3.2 燈盞花的遺傳轉(zhuǎn)化67-71
• 4.3.2.1 燈盞花對(duì)Kan的敏感性67
• 4.3.2.2 燈盞花對(duì)Cef的敏感性67-70
• 4.3.2.3 篩選培養(yǎng)70-71
• 4.4 小結(jié)71-72
• 第5章 討論72-75
• 5.1 通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取目的基因的方法討論72-73
• 5.2 關(guān)于燈盞花MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能討論73-74
• 5.3 燈盞花遺傳轉(zhuǎn)化體系建立過程中遇到的問題74-75
• 參考文獻(xiàn)75-83
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和研究成果83-84
• 致謝84

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本文編號(hào)：1130534