本文關(guān)鍵詞：惡臭假單胞菌KT2442類脂A結(jié)構(gòu)多樣性及相關(guān)基因研究

  更多相關(guān)文章： 惡臭假單胞菌KT2442 磷脂 類脂A 類脂A脫�；� 類脂A雙加氧酶 類脂A脂肪酸轉(zhuǎn)移酶

【摘要】：重要工業(yè)生產(chǎn)菌株惡臭假單胞菌是革蘭氏陰性菌,其細(xì)胞表層分布大量脂多糖分子,對細(xì)胞的生長和代謝調(diào)控起著重要作用;但這些脂多糖分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)目前未見報(bào)道。本論文利用生物化學(xué)、分析化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù),對惡臭假單胞菌KT2442細(xì)胞表層類脂A分子結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行了研究,并鑒定了相關(guān)基因功能。主要研究結(jié)論如下:(1)從惡臭假單胞菌KT2442細(xì)胞膜中提取純化脂質(zhì)分子,并通過TLC、HPLC和ESI/MS/MS分析,確定了惡臭假單胞菌KT2442細(xì)胞膜中的磷脂組分和類脂A結(jié)構(gòu)。磷脂中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、心磷脂的含量分別為79.9%、12.7%和7.4%;磷脂脂肪酸鏈組成主要為C16:1和C18:1。惡臭假單胞菌KT2442中至少存在六種不同的類脂A分子結(jié)構(gòu),脂肪酸鏈組成主要為C_(10)和C_(12)。(2)鑒定了KT2442染色體上的基因PP_0737和PP_3154均編碼類脂A的脫�；�,能夠去除類脂A分子3位上的脂肪酸鏈,因而將這兩個(gè)基因分別命名為pag L1和pag L2。首先通過在大腸桿菌W3110和HW001中進(jìn)行異源表達(dá),初步鑒定這兩個(gè)基因均能編碼脫�；�;接著在KT2442中構(gòu)建pag L1和pag L2的單敲除和雙敲除突變株,進(jìn)一步確定了這兩個(gè)基因在KT2442中能夠編碼脫�；�;最后在雙敲除突變株中進(jìn)行了這兩個(gè)基因的回補(bǔ)表達(dá),驗(yàn)證這兩個(gè)基因都能編碼脫�；�。(3)系統(tǒng)研究了不同培養(yǎng)環(huán)境對pagL1和pagL2轉(zhuǎn)錄及類脂A脫�；挠绊�。將KT2442在不同溫度、二甲苯濃度、鋅離子濃度、鎂離子濃度、p H條件下進(jìn)行培養(yǎng)。pag L1的轉(zhuǎn)錄水平在高濃度鋅離子和高濃度的鎂離子條件下發(fā)生下調(diào);pag L2的轉(zhuǎn)錄水平在高濃度二甲苯、高濃度鋅離子、低濃度的鎂離子條件下發(fā)生了上調(diào);另外溫度和鋅離子主要影響了Pag L1和Pag L2的酶活。脫�；诫S著溫度和二甲苯濃度的升高而升高,隨著鋅離子濃度和鎂離子濃度的升高而降低。(4)系統(tǒng)研究了Pho P-Pho Q和ColR-ColS雙組份調(diào)控系統(tǒng)在不同環(huán)境條件下對pagL1和pag L2的影響。將兩個(gè)調(diào)控系統(tǒng)的敲除突變株在不同二甲苯濃度、鋅離子濃度和鎂離子濃度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。Pho P-Pho Q在高鎂和低鎂條件下均上調(diào)類脂A的脫�；�;Col R-Col S在LB條件和高鎂離子條件下輕微下調(diào)了脫�；�;Col R-Col S在二甲苯存在時(shí)上調(diào)了脫�；傅恼w水平;在低鎂離子條件下,Col R-Col S對于類脂A脫�；{(diào)控規(guī)律不定。(5)初步研究發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌KT2442染色體上的基因PP_2423和PP_4570能編碼類脂A的雙加氧酶,該酶能夠在2位次級脂肪酸鏈上添加一個(gè)3-OH,因而將這兩個(gè)基因命名為lpx O1和lpx O2。PP_1735能夠編碼類脂A的脂肪酸轉(zhuǎn)移酶,能夠在2’位上添加一條C_(12)的次級脂肪酸鏈,因而將這個(gè)基因命名為lpx L2;初步鑒定PP_0024能夠編碼類脂A的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶,能在1或者4’位的磷酸基團(tuán)上添加磷酸乙醇胺,因而將這個(gè)基因命名為eptA。
【關(guān)鍵詞】：惡臭假單胞菌KT2442 磷脂 類脂A 類脂A脫�；� 類脂A雙加氧酶 類脂A脂肪酸轉(zhuǎn)移酶
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q93
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 緒論9-19
• 1.1 革蘭氏陰性菌膜壁脂質(zhì)結(jié)構(gòu)9-16
• 1.1.1 革蘭氏陰性菌的磷脂9-11
• 1.1.2 大腸桿菌脂多糖和類脂A的合成途徑11-12
• 1.1.3 類脂A的結(jié)構(gòu)多樣性12-15
• 1.1.4 類脂A的調(diào)控15-16
• 1.2 惡臭假單胞菌KT244216-17
• 1.3 立題依據(jù)和研究意義17
• 1.4 研究內(nèi)容17-19
• 第二章 材料與方法19-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備19-23
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒19-20
• 2.1.2 主要引物20-21
• 2.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件21-22
• 2.1.4 工具酶和試劑22
• 2.1.5 主要儀器22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-30
• 2.2.1 分子操作23-26
• 2.2.2 類脂A的提取26-27
• 2.2.3 磷脂的提取27
• 2.2.4 薄層層析和質(zhì)譜鑒定27-28
• 2.2.5 磷脂的高效液相色譜28
• 2.2.6 RT-PCR28-30
• 第三章 結(jié)果和討論30-78
• 3.1 KT2442磷脂和類脂A組分和結(jié)構(gòu)鑒定30-34
• 3.1.1 磷脂組分和結(jié)構(gòu)鑒定30-31
• 3.1.2 類脂A結(jié)構(gòu)鑒定31-34
• 3.2 pagL1和pagL2基因功能鑒定34-39
• 3.3 環(huán)境條件對pagL1、pagL2的調(diào)控探究39-51
• 3.3.1 不同溫度對類脂A脫�；绊�39-42
• 3.3.2 二甲苯對類脂A脫�；挠绊�42-45
• 3.3.3 不同鋅離子濃度對類脂A脫酰基化的影響45-48
• 3.3.4 不同鎂離子濃度對類脂A脫�；绊�48-51
• 3.3.5 不同pH對類脂A脫�；绊�51
• 3.4 二元調(diào)控系統(tǒng)對類脂A脫�；挠绊�51-71
• 3.4.1 LB環(huán)境下PhoP-Pho Q對類脂A脫�；挠绊�52-54
• 3.4.2 二甲苯存在環(huán)境下Pho P-Pho Q對類脂A脫�；挠绊�54-56
• 3.4.3 高濃度鋅離子條件下Pho PQ對脫�；δ艿挠绊�56-58
• 3.4.4 高濃度鎂離子條件下Pho P-Pho Q對類脂A脫�；挠绊�58-59
• 3.4.5 低濃度鎂離子條件下Pho P-Pho Q對類脂A脫�；挠绊�59-61
• 3.4.6 LB條件下ColR-ColS調(diào)控系統(tǒng)對類脂A脫�；挠绊�61-62
• 3.4.7 二甲苯存在條件下ColR-ColS對類脂A脫�；挠绊�62-65
• 3.4.8 鋅離子存在條件下ColR-ColS對類脂A脫�；挠绊�65-67
• 3.4.9 高鎂離子條件下ColR-ColS對類脂A脫�；挠绊�67-68
• 3.4.10 低鎂離子條件下ColR-ColS對類脂A脫�；挠绊�68-70
• 3.4.11 Pho P-Pho Q和ColR-ColS調(diào)控方式分析70-71
• 3.5 其他類脂A相關(guān)基因功能探究71-78
• 3.5.1 lpxO1、lpxO2基因功能鑒定71-73
• 3.5.2 lpxL2基因功能鑒定73-75
• 3.5.3 eptA基因功能初步探究75-76
• 3.5.4 其他類脂A相關(guān)基因存在的可能性探究功能初步探究76-78
• 主要結(jié)論與展望78-80
• 主要結(jié)論78-79
• 展望79-80
• 致謝80-81
• 參考文獻(xiàn)81-86
• 附錄86-88
• 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文88

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