本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用16S rRNA基因測序技術(shù)初步分析院內(nèi)獲得性銅綠假單胞菌肺炎患者肺內(nèi)菌群

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【摘要】：目的:運(yùn)用16S rRNA基因測序技術(shù)分析神經(jīng)外科重癥監(jiān)護(hù)室(Neurosurgical Intensive Care Unit,NICU)銅綠假單胞菌性院內(nèi)獲得性肺炎(Hospital Acquired Pneumonia,HAP)患者感染前和感染時肺內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的變化,為HAP的診斷和治療提供新的理念和思路。方法:對自2013年12月至2015年12月NICU住院患者按如下條件進(jìn)行篩選:1)入院時不合并肺損傷且無肺炎的中重型腦損傷個體;2)入院48小時內(nèi)行氣管切開;3)入院48小時后無HAP下利用纖維支氣管鏡經(jīng)氣管切口采集標(biāo)本,細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果提示陰性;4)首次出現(xiàn)HAP的標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果僅提示銅綠假單胞菌,連著2次及以上培養(yǎng)結(jié)果均僅提示銅綠假單胞菌。將近期有抗生素使用史,不適合做纖維支氣管鏡的,第二次標(biāo)本未取到或培養(yǎng)結(jié)果非銅綠假單胞菌或合并其他病原菌的個體去除。根據(jù)標(biāo)本采集時是否存在HAP將標(biāo)本分為感染前組和感染組,標(biāo)本采集后分為兩份,一份送檢驗(yàn)科行細(xì)菌培養(yǎng),一份直接低溫凍存為高通量測序做準(zhǔn)備。臨床信息收集包括流行病學(xué)資料,臨床癥狀及體征、化驗(yàn)結(jié)果和影像學(xué)檢查結(jié)果等。從群落結(jié)構(gòu)和功能分析銅綠假單胞菌感染性HAP患者感染前和感染時的菌群結(jié)構(gòu)和功能變化。結(jié)果:本項(xiàng)研究共納入來自10例患者自身對照的20份樣本,每例患者感染前和感染時各1份樣本,感染前組和感染組分別含有10份樣本。我們將從不同分類水平、β多樣性、主成分分析、α多樣性和功能基因5個角度對結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。1)屬水平共有459種菌群,感染前組的優(yōu)勢菌群為嗜血桿菌屬、普氏菌屬、鏈球菌屬和奈瑟氏菌屬,在感染前組和感染組的含量分別為:25.0%vs 0.8%、21.0%vs 0.8%、12.7%vs 5.1%、9.0%vs 12.9%;感染組優(yōu)勢菌為普氏菌屬、假單胞菌屬、奈瑟氏菌屬、單食胞菌屬,在感染組和感染前組的含量分別為24.4%vs 21.0%、20.2%vs 0.3%、12.9%vs 9.0%、6.3%vs 0.02%。同一個體感染前和感染時菌群共有率較低,均低于60%。459種菌群中的25種分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,包括優(yōu)勢菌群:假單胞菌屬、嗜血桿菌屬;2)科水平共有289種菌群,感染前組優(yōu)勢菌群為巴斯德氏菌科,鏈球菌科,普雷沃氏菌科,在感染前組和感染組的含量分別為27.95%vs1.34%、12.65%vs 5.11%、11.39%vs 11.82%;感染組優(yōu)勢菌為假單胞菌科,奈瑟氏菌和Paraprevotellaceae,在感染前組和感染組的含量分別為20.24%vs 0.31%、13.78%vs 9.28%、12.58%vs 9.62%。289種菌群中有15種菌群存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,包括優(yōu)勢菌群:巴斯德氏菌科,假單胞菌科。3)目水平共有172種菌群,感染前組優(yōu)勢菌群為巴斯德氏菌目,擬桿菌目,乳酸桿菌目,在感染前組和感染組的含量分別為27.95%vs 1.34%,24.33%vs 28.66%,13.87%vs 5.38%。感染組優(yōu)勢菌為擬桿菌目,假單胞菌目,奈瑟氏菌目,在感染前組和感染組的含量分別為28.66%vs 24.33%,23.28%vs 0.58%,13.78%vs9.28%。172種菌群中8種菌群存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,包括優(yōu)勢菌群:巴斯德氏菌目和假單胞菌目。4)綱水平共有87種菌群,感染前優(yōu)勢菌群為γ變形菌綱,擬桿菌綱,芽孢桿菌綱,在感染前組和感染組的含量分別為33.39%vs 31.34%,24.33%vs 28.66%,14.87%vs 5.67%。感染組優(yōu)勢菌為γ變形菌綱,擬桿菌綱,β變形菌綱,在感染前組和感染組的含量分別為31.34%vs 33.39%,28.66%vs 24.33%,14.48%vs 10.03%。87種菌群中僅有3種菌群存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不包括優(yōu)勢菌群。5)在門水平上兩組共有37種菌群,變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門是兩組共同的優(yōu)勢菌群,在感染前組和感染組的含量分別為44.8%vs 46.5%,26.4%vs30.6%,18.7%vs 12.1%。37種菌群中只有2種存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不包括優(yōu)勢菌群。同一個體感染前和感染時菌群共有率最低為39.1%,最高為88.9%,10個自身對照匹配組中只有1組共有率為39.1%,其余均在60%以上。6)β多樣性分析和屬水平主成分分析利用樣品之間菌群的進(jìn)化信息以及菌群的豐度信息,進(jìn)行Unifrac分析,得到樣品間差異的距離矩陣信息,進(jìn)行PCo A分析和NMDS分析以及應(yīng)用R軟件對屬水平上的分類及菌群豐度進(jìn)行主成分分析,均發(fā)現(xiàn)相同個體感染前和感染時、感染前組和感染組組間及組內(nèi)樣本間距離較遠(yuǎn),說明菌群組成差異性較大。7)α多樣性指標(biāo)Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映群落多樣性和豐富度的α多樣性指標(biāo)在兩組間分布無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8)各樣本中群落功能基因共包括7大類和41小類,其中環(huán)境和信息處理中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)、遺傳信息處理中的復(fù)制和修復(fù)、新陳代謝中的糖代謝和氨基酸代謝為感染前組和感染組的共同優(yōu)勢功能基因,比例分別為11.2%、9.7%、9.4%、9.1%和10.1%、8.5%、8.9%、10.1%。41種功能基因中8種存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中包括氨基酸代謝相關(guān)基因。結(jié)論:1、感染前組和感染組分析發(fā)現(xiàn):1)菌群組成在屬、科、目水平上存在明顯差異,尤其是優(yōu)勢菌分布,在綱和門水平上差異較小;2)兩組間菌群進(jìn)化信息及豐度信息存在明顯差異;3)功能基因分布差異性較小。2、相同個體感染前和感染時標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn):1)菌群組成在屬、科、目、綱水平上存在明顯差異,尤其是優(yōu)勢菌群種類及含量,在門水平上差異較小;2)兩標(biāo)本間菌群進(jìn)化信息及豐度信息存在明顯差異;3)功能基因分布差異性較小。3、不同個體標(biāo)本在感染前組和感染組組內(nèi)分析發(fā)現(xiàn):組內(nèi)各樣本菌群在各分類水平上均存在明顯差異,功能基因及豐度差異性較小。4、該研究成果初步展示了中重度顱腦損傷患者在NICU治療期間,銅綠假單胞菌性HAP發(fā)生前和感染時肺內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了根本性變化,為今后HAP的診斷及治療提供了理論基礎(chǔ)與依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：16S rRNA 基因 院內(nèi)獲得性肺炎 銅綠假單胞桿菌 神經(jīng)外科重癥監(jiān)護(hù)室
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R563.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-13
• 前言13-16
• 研究現(xiàn)狀、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 1.實(shí)驗(yàn)對象16-18
• 1.1 實(shí)驗(yàn)對象16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)分組16
• 1.3 樣本編號規(guī)則16
• 1.4 院內(nèi)獲得性肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)16
• 1.5 病原學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)16
• 1.6 入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)16-18
• 2.實(shí)驗(yàn)方法18-24
• 2.1 樣本采集18
• 2.2 傳統(tǒng)的樣本中病原學(xué)診斷技術(shù)18-19
• 2.3 16S rRNA基因測序技術(shù)19-22
• 2.3.1 宏基因組(Metagenome)19
• 2.3.2 技術(shù)路線19-20
• 2.3.3 數(shù)據(jù)分析流程20-22
• 2.4 臨床信息采集22-23
• 2.5 統(tǒng)計(jì)分析23-24
• 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-57
• 3.1 基本信息24
• 3.2 結(jié)果分析流程24-30
• 3.2.1 有效序列24
• 3.2.2 優(yōu)質(zhì)序列24-28
• 3.2.3 優(yōu)質(zhì)序列的長度分析28-29
• 3.2.4 OTU聚類及注釋29-30
• 3.3 基于菌群豐度分析30-32
• 3.3.1 稀釋曲線30-31
• 3.3.2 α多樣性分析31-32
• 3.4 基于群落結(jié)構(gòu)分析32-48
• 3.4.1 樣品群落組成分析32-33
• 3.4.2 門水平33-45
• 3.4.3 屬水平45-48
• 3.5 含進(jìn)化關(guān)系的菌群豐度分布48-49
• 3.6 β多樣性分析49-51
• 3.7 主成分分析51-52
• 3.8 聚類分析52-53
• 3.9 群落功能基因預(yù)測53-57
• 4.討論57-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明68-69
• 綜述 淺談16S rRNA基因測序技術(shù)與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)在院內(nèi)獲得性肺炎病原菌診斷中的應(yīng)用69-79
• 綜述參考文獻(xiàn)76-79
• 致謝79-80
• 個人簡歷80

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1 華蔚穎;徐昭;張夢暉;李e，

本文編號：1122535