本文關(guān)鍵詞：滇重樓糖基轉(zhuǎn)移酶基因及細胞色素P450基因的表達研究

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【摘要】：目的滇重樓植物為云南省道地藥材,是云南白藥、宮血寧膠囊等著名中成藥的主要原料之一,具有極高的經(jīng)濟價值和市場前景。而細胞色素P450酶及糖基轉(zhuǎn)移酶都是甲羥戊酸途徑上對滇重樓主要有效成分--甾體皂苷合成具有重要作用的酶。本文通過研究滇重樓植物的糖基轉(zhuǎn)移酶基因及細胞色素P450基因,為后續(xù)人工調(diào)控滇重樓次生代謝的生物合成研究奠定基礎(chǔ)。方法1、克隆技術(shù),通過滇重樓c DNA文庫中分析并獲取的滇重樓植物的P450基因及糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列,通過該序列設(shè)計引物。提取滇重樓植物RNA反轉(zhuǎn)錄形成第一鏈c DNA作為模板,進行PCR,獲取該序列的全長。將PCR產(chǎn)物純化連入克隆載體,轉(zhuǎn)化進入Trans1-T1大腸桿菌細胞,菌落PCR驗證測序并保存。2、原核表達技術(shù),構(gòu)建表達載體,轉(zhuǎn)化Trans1-T1大腸桿菌細胞進行大量表達,進行菌落PCR及測序,質(zhì)粒提取,轉(zhuǎn)化Trans BL21(DE3)表達大腸桿菌,誘導表達,提取其總蛋白,SDS-PAGE電泳驗證蛋白表達結(jié)果。3、實時熒光定量PCR,對滇重樓植物的根莖、莖、葉三個部分分別進行RNA的提取,反轉(zhuǎn)錄各自形成第一鏈c DNA,選擇Actin1n基因作為內(nèi)參基因,設(shè)計引物進行實時熒光定量PCR,分析實驗結(jié)果。4、真核表達系統(tǒng)構(gòu)建,構(gòu)建p PIC9K-P450載體,轉(zhuǎn)入TOP10大腸桿菌進行大量制備,提取質(zhì)粒。制備GS115酵母感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化,PCR鑒定實驗結(jié)果。結(jié)果獲取滇重樓植物的糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列全長為870bp,通過生物信息學分析糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼289個氨基酸,產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子量為31532.6D,理論等電點為5.63,為一個疏水性蛋白。與無油樟植物的糖基轉(zhuǎn)移酶基因具有較高的同源性,具有一個跨膜區(qū)域。成功構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶基因的原核表達載體,并在大腸桿菌中獲得表達,SDS-PAGE電泳顯示在31.5k D處具有特異性蛋白。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,糖基轉(zhuǎn)移酶基因在滇重樓植物中根莖和葉的表達量相近,超過在莖中的表達量的兩倍。獲取滇重樓植物的細胞色素P450基因序列全長為1518bp,通過生物信息學分析細胞色素P450基因編碼505個氨基酸,產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子量為57735.2D,理論等電點為7.68,為一個親水性蛋白。與海棗、油棕植物的細胞色素P450基因具有較高的同源性,具有一個跨膜區(qū)域,成功構(gòu)建細胞色素P450基因的原核表達載體,并在大腸桿菌中獲得表達,SDS-PAGE電泳顯示在57.7k D處具有特異性蛋白。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,細胞色素P450基因在滇重樓植物的根莖中的表達量最高,超過在莖和葉中的表達量的兩倍,莖和葉中的表達量相近。并成功構(gòu)建細胞色素P450的真核表達系統(tǒng)。結(jié)論本文成功克隆出滇重樓植物的糖基轉(zhuǎn)移酶基因及細胞色素P450基因的全長,并成功構(gòu)建了兩個基因的原核表達系統(tǒng),為今后滇重樓植物其他途徑的糖基轉(zhuǎn)移酶基因及細胞色素P450研究提供了一定方法及依據(jù)。成功構(gòu)建細胞色素P450基因的真核表達系統(tǒng),為其他基因在真核細胞中的表達研究提供參考。熒光定量PCR結(jié)果顯示,兩個基因在用藥部位根莖中的表達量均為最高,為后續(xù)兩個基因?qū)Φ嶂貥侵参镉行С煞趾铣捎绊懷芯刻峁┮欢ǖ难芯恳罁?jù)。
【關(guān)鍵詞】：滇重樓 細胞色素P450 糖基轉(zhuǎn)移酶 表達研究
【學位授予單位】：云南中醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S567.239;Q943.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略詞11-12
• 前言12-15
• 第一章 糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆原核表達及實時熒光定量PCR分析15-39
• 1 引言15-16
• 2 材料與方法16-26
• 2.1 實驗材料16-18
• 2.2 實驗方法18-26
• 3 結(jié)果與分析26-37
• 3.1 克隆26-28
• 3.2 原核表達28-29
• 3.3 熒光定量29-32
• 3.4 糖基轉(zhuǎn)移酶基因的生物信息學分析32-37
• 4 結(jié)論37-39
• 第二章 P450基因的克隆原核表達、實時熒光定量RCR及真核表達構(gòu)建39-62
• 1 引言39
• 2 材料與方法39-47
• 2.1 實驗材料39-42
• 2.2 實驗方法42-47
• 3 結(jié)果與分析47-60
• 3.1 克隆47-48
• 3.2 原核表達48-49
• 3.3 熒光定量PCR49-53
• 3.4 真核表達體系構(gòu)建結(jié)果分析53-54
• 3.5 生物信息學分析54-60
• 4 結(jié)論60-62
• 文獻綜述62-72
• 參考文獻72-75
• 附錄75-83
• 碩士期間研究成果83-84
• 致謝84

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1 趙庭周;;滇重樓可持續(xù)采收方法初探[J];中國野生植物資源;2012年01期

2 陳昌祥,連紅兵,李運昌,周俊;滇重樓種子中的甾體皂甙[J];云南植物研究;1990年04期

3 王德貴;;滇重樓栽培管理技術(shù)[J];民營科技;2014年05期

4 陳昌祥,周俊;滇產(chǎn)植物皂素成分的研究 Ⅴ.滇重樓的甾體皂甙和β-蛻皮激素[J];云南植物研究;1981年01期

5 李運昌;滇重樓的無性繁殖[J];云南植物研究;1986年04期

6 李運昌;重樓屬植物引種栽培的研究 Ⅱ.滇重樓的育苗試驗[J];云南植物研究;1986年02期

7 王世林,周立剛,李英,蔡妙英;滇重樓寄生菌的研究[J];微生物學報;1999年02期

8 ;滇重樓優(yōu)良品種選育及三段栽培法研究與示范取得突破性進展[J];云南科技管理;2010年02期

9 王世林，趙永靈，李曉玉，，李運昌，李恒;粉質(zhì)和膠質(zhì)滇重樓的研究[J];云南植物研究;1996年03期

10 譚偉;戴建輝;熊勇;楊敏;王紅斌;;滇重樓皂苷提取及含量測定[J];云南民族大學學報(自然科學版);2010年02期

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1 王世林;許云龍;;滇重樓研究進展[A];西部地區(qū)第二屆植物科學與開發(fā)學術(shù)討論會論文摘要集[C];2001年

2 黃瑋;孟繁蘊;張文生;崔曉星;王永炎;;滇重樓種子休眠機理研究[A];全國第8屆天然藥物資源學術(shù)研討會論文集[C];2008年

3 孟繁蘊;鄧子超;張文生;王永炎;;滇重樓種胚休眠和發(fā)育過程中內(nèi)源激素變化的研究[A];2006海峽兩岸暨CSNR全國第七屆天然藥物資源學術(shù)研討會論文集[C];2006年

4 曹曉冬;周立剛;李靜;徐利劍;趙江林;;滇重樓內(nèi)生真菌及其甾體化合物初步研究[A];中國植物病理學會2006年學術(shù)年會論文集[C];2006年

5 康利平;余河水;劉奕訓;趙陽;熊呈琦;譚大維;Kate Yu;高月;馬百平;;利用UPLC/oa-TOF MS~E快速分析鑒定滇重樓的化學成分[A];中國化學會第八屆天然有機化學學術(shù)研討會論文集[C];2010年

6 裴衛(wèi)華;曹繼芬;楊明英;李向東;孫道旺;李紹平;趙志堅;;滇重樓一種莖腐新病害病原的分離鑒定[A];中國植物病理學會2011年學術(shù)年會論文集[C];2011年

7 孟繁蘊;張文生;韓建萍;馮成強;張義玲;王永炎;;滇重樓種胚發(fā)育和休眠與種子內(nèi)源激素關(guān)系的研究[A];全國第二屆中藥資源生態(tài)學學術(shù)研討會論文集[C];2006年

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1 本報記者 陳澤;滇重樓種植走向規(guī)�；�(guī)范化[N];云南政協(xié)報;2013年

2 記者 熊燕;滇重樓種子快速萌發(fā)有新突破[N];云南日報;2014年

3 巍山縣農(nóng)業(yè)局 沈嘉彬;滇重樓栽培管理[N];云南科技報;2011年

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1 高成杰;滇重樓生物量分配與環(huán)境調(diào)控機制研究[D];中國林業(yè)科學研究院;2015年

2 李燾;滇重樓與七葉一枝花化學成分及生物活性的研究[D];陜西師范大學;2011年

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1 夏從芳;滇重樓內(nèi)生真菌雜色曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中丁內(nèi)酯類化合物的研究[D];云南民族大學;2015年

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7 王進波;滇重樓鯊烯合酶和環(huán)阿屯醇合酶的基因克隆與序列分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2012年

8 王羽;滇重樓抗腫瘤活性成分的研究[D];天津大學;2007年

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10 李靜;滇重樓內(nèi)生真菌及其抗菌活性檢測和甾體化合物分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2007年

本文編號：1121122