本文關(guān)鍵詞：沉默CCR和CAD基因培育低木質(zhì)素含量轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

７２－８３２０１３年１０月　　　草　業(yè)　學(xué)　報　　　

ＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　　　　Ａ　　第２２卷　第５期

Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５

沉默ＣＣＲ和ＣＡＤ基因培育低木質(zhì)素

含量轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草

２２２，，，胡可１，嚴(yán)雪鋒１，栗丹１，唐曉梅１，楊宏１，王艷１，鄧洪淵１，馬欣榮１＊

（）中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都６中國科學(xué)院研究生院，北京１１．１００４１；２．０００４９

摘要：木質(zhì)素作為維管植物的重要成分之一，主要存在于細(xì)胞的次生壁中。然而，木質(zhì)素卻是許多工農(nóng)業(yè)加工過程的限制因素，例如在化學(xué)制漿、牧草消化以及木質(zhì)纖維轉(zhuǎn)化為生物酒精等過程中。肉桂酰輔酶Ａ還原酶（和ＣＣＲ）是催化木質(zhì)素單體生物合成最后兩步的關(guān)鍵酶。本研究根據(jù)Ｎ肉桂醇脫氫酶（ＣＡＤ）ＣＢＩ中黑麥草ＣＣＲ和ＣＡＤ基從野生型多年生黑麥草ｃ分別因序列設(shè)計特異引物并添加相應(yīng)酶切位點，ＤＮＡ分離克�。茫茫液停茫粒幕蚱�，構(gòu)建了含正反方向目的片段的植物表達(dá)干擾載體ｐ２３２３ｉＣＣＲ和ｐｉＣＡＤ。通過根癌農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５介導(dǎo)轉(zhuǎn)入多－－年生黑麥草胚性愈傷組織，經(jīng)過巴龍霉素篩選和ＰＣＲ檢測獲得導(dǎo)入了干擾ＣＣＲ和ＣＡＤ基因片段的轉(zhuǎn)基因株系結(jié)果顯示，與對照相比，有９株ｉｉＣＲ和ｉＡＤ。常規(guī)方法測定相對木質(zhì)素含量，ＣＲ植株和１１株ｉＡＤ植株木－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｃ質(zhì)素含量顯著降低，分別平均降低了３且生長正常。本研究表明通過干擾Ｃ４．６７％，３３．８６％，ＣＲ和ＣＡＤ基因表可以獲得低木質(zhì)素含量的多年生黑麥草，為進(jìn)一步培育易消化吸收的黑麥草提供了良好的種質(zhì)資源。達(dá)，

；關(guān)鍵詞：木質(zhì)素；肉桂酰輔酶Ａ還原酶；肉桂醇脫氫酶；多年生黑麥草；遺傳轉(zhuǎn)化ＲＮＡｉ

＋

（）中圖分類號：Ｓ８１６；Ｓ５４６．６０３；Ｑ９４３．２　　文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ　　文章編號：１００４５７５９２０１３０５００７２１２－－－

：／ＤＯＩ１０．１１６８６ｃｘｂ２０１３０５０９　�。�

主要存在于植物細(xì)胞的次生壁，與纖維素和半纖維素共價結(jié)合，　　木質(zhì)素是一種復(fù)雜的芳香族化合物多聚體，

賦予細(xì)胞壁強度和硬度，為植物組織提供機械支持，使得植株向上生長。木質(zhì)素還使植物的脈管組織具有疏水

１］２］

，。在大多數(shù)被子植物中，性，便于水分和營養(yǎng)物質(zhì)的長距離運輸［還能保護(hù)植株避免病原體入侵［木質(zhì)素主要

）和紫丁香基木質(zhì)素（這兩種木質(zhì)素單體亞單位構(gòu)成，它們分別來自松柏醇由愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（ＧｌｉｎｉｎＳｌｉｎｉｎ）－－ｇｇ和芥子醇，第三種木質(zhì)素單體亞單位對羥基苯基木質(zhì)素（來自香豆醇，它在單子葉植物中相對較多，而Ｈ－ｌｉｎｉｎ）ｇ

１］３，４］

。圖１為木質(zhì)素合成途徑［。在雙子葉植物中較少［

５］

。木質(zhì)素作為維管束植物細(xì)胞壁的主要成分，長期以來被認(rèn)為不利于飼料品質(zhì)、造紙和纖維素燃料的生產(chǎn)［

６］

。在草料消化和例如，在制漿造紙工業(yè)中，需通過嚴(yán)格的化學(xué)工藝從木材中去除木質(zhì)素以獲得純的纖維素纖維［７］

。因此，低木質(zhì)素含量的牧草或者木材的培育，是育種的方向之一。如生產(chǎn)乙醇時木質(zhì)素也是主要的限制因子［

今大部分研究主要是通過基因工程手段降低植株的木質(zhì)素含量或者改變其組成。

［３，４］

，木質(zhì)素單體作為組成木質(zhì)素的亞單位，產(chǎn)生于苯丙氨酸途徑的一個分支（圖１）肉桂酰輔酶Ａ還原酶

（，，和肉桂醇脫氫酶（是催化木質(zhì)素單體生ｃｉｎｎａｍｏｌＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅＣＣＲ）ｃｉｎｎａｍｌａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｄｒｏｅｎａｓｅＣＡＤ）　　　�。缥锖铣勺詈髢刹降年P(guān)鍵酶。許多研究通過在不同植物中抑制這兩種酶的表達(dá)降低了木質(zhì)素含量或是改變了木質(zhì)

１］

。素的組成［

在木質(zhì)素的生物合成中起著重要作用，它以５種羥基肉桂酸的ＣＣＣＲ是木質(zhì)素特異途徑的關(guān)鍵酶之一，ｏＡ酯（對－香豆酰輔酶Ａ、咖啡酰輔酶Ａ、阿魏酰輔酶Ａ、作為底物催化生成相５－羥基阿魏酰輔酶Ａ和芥子酰輔酶Ａ）應(yīng)的肉桂醛。Ｃ突變體，木質(zhì)素含量降低的同時表現(xiàn)出外ＣＲ１基因表達(dá)受影響的擬南芥（Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）�。�

８］

。Ｃ形矮小、衰老延緩的性狀［木質(zhì)素含量可降低ＣＲ下調(diào)的轉(zhuǎn)基因楊樹（Ｐｏｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａ×Ｐｏｕｌｕｓａｌｂａ）　　ｐｐ

；改回日期：２０１２０５０７２０１２０６０６＊收稿日期：－－－－

））基金項目：國家８和國家自然科學(xué)基金項目（資助。６３計劃項目（２００９ＡＡ１０Ｚ１０８，２００８ＡＡ１０Ｚ４０９３０１７０５８９，：＿作者簡介：胡可（男，四川江油人，碩士。Ｅ－ｍ１９８６ａｉｌｄｄ１２２＠１６３．ｃｏｍ－）ｊｙｊｙ

：ａｉｌｍａｘｒｉｂ．ａｃ．ｃｎ＊通訊作者。Ｅ－ｍ＠ｃ

３，４］

圖１　苯丙烷和木質(zhì)素單體生物合成途徑，重點顯示了木質(zhì)素單體的合成途徑［

Ｆｉ．１�。校瑁澹睿欤颍铮幔睿铮椋洌幔睿洌恚铮睿铮欤椋睿铮欤猓椋铮螅睿簦瑁澹簦椋悖幔簦瑁鳎幔螅恚幔椋睿欤螅瑁铮鳎椋睿猓椋铮螅睿簦瑁澹螅椋螅幔簦瑁鳎幔螅铮妫恚铮睿铮欤椋睿铮欤蟆　　　　　　　。纾穑穑纾穑纾穑纭　�

；；ＡＬ：苯丙氨酸解氨酶ＰｈｅａｍｍｏｎｉａｌａｓｅＣ４Ｈ：肉桂酸４ｉｎｎａｍａｔｅ４ｈｄｒｏｘｌａｓｅ４ＣＬ：４ｈｄｒｏｘｃｉｎ�。小。u化酶Ｃ�。u基肉桂酰輔酶Ａ連接酶４－－ｙｙｙｙｙ；；Ｃ／ｎａｍｏｌｏＡｌｉａｓｅＣ３Ｈ：對香豆酸３ｃｏｕｍａｒａｔｅ３ｈｄｒｏｘｌａｓｅＯＭＴ：咖啡酸／５ａｆｆｅｉｃ５ｈｄｒｏｘｆｅｒｕｌｉｃ－Ｃ�。u化酶ｐ－　－－羥基阿魏酸－Ｏ－甲基轉(zhuǎn)移酶Ｃ－ｙｇｙｙｙｙ；；ＨＣ；Ｏ－ｍｅｔｈｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＦ５Ｈ：阿魏酸５ｅｒｕｌａｔｅ５ｈｄｒｏｘｌａｓｅＴ：羥基肉桂酸轉(zhuǎn)移酶ＨｄｒｏｘｃｉｎｎａｍｏｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＣＣｏＡＯＭＴ：咖ａｃｉｄ�。u化酶Ｆ　－ｙｙｙｙｙｙ；；啡酰輔酶Ａ甲基轉(zhuǎn)移酶ＣａｆｆｅｏｌｏＡ�。希恚澹簦瑁欤簦颍幔睿螅妫澹颍幔螅澹茫茫遥喝夤瘐＃茫铮吝�原酶ＣｉｎｎａｍｏｌｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅＣＡＤ：肉桂醇脫氫酶Ｃｉｎｎａｍｌａｌ－Ｃ－Ｃ�。�；；蘆丁：Ｒ；山奈酚二糖苷阿魏酸：ｌｃｏｓｉｄｅｃｏｈｏｌｄｅｈｄｒｏｅｎａｓｅＳＡＤ：芥子醇脫氫酶Ｓｉｎａｌａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｄｒｏｅｎａｓｅ．蘆�。罚酰簦椋睿罚酰簦椋睢。。擒眨海遥纾穑纾纾簧侥畏佣擒毡狨ィ海耍簧侥畏樱�；黃酮類化Ｋａｅｍｆｅｒｏｌｄｉｌｃｏｓｉｄｅｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄａｅｍｆｅｒｏｌｄｉｌｃｏｓｉｄｅｍａｌｏｎａｔｅａｅｍｆｅｒｏｌｌｃｏｓｉｄｅ　　　　　－糖苷：Ｋ－Ｏ－ｐｇｙｐｇｙｐｇｙ；苯丙氨酸：；肉桂酸：；對－香豆酸：；咖啡酸：；阿魏酸：；合物：ＦｌａｖｏｎｏｉｄＰｈｅｎｌａｌａｎｉｎｅＣｉｎｎａｍｉｃａｃｉｄｃｏｕｍａｒｉｃａｃｉｄＣａｆｆｅｉｃａｃｉｄＦｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ５�。　　。u基ｙｐ；芥子酸：；對－香豆酰輔酶Ａ：；香豆酰奎尼阿魏酸：５ｄｒｏｘｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄＳｉｎａｉｃａｃｉｄｃｏｕｍａｒｏｌｏＡ；香豆酰莽草酸：Ｃｏｕｍａｒｏｌｓｈｉｋｉｍｉｃａｃｉｄ－Ｈ　　－－Ｃ　�。穑穑�；咖啡酰輔酶Ａ：酸：ＣｏｕｍａｒｏｌａｃｉｄＣａｆｆｅｏｌｏＡ；阿魏酰輔酶Ａ：ＦｅｒｕｌｏｌｏＡ；５５ｈｄｒｏｘｆｅｒｕｌｏｌｏＡ；芥子酰輔酶ｕｉｎｉｃ　　－Ｃ－Ｃ－羥基阿魏酰輔酶Ａ：－－Ｃｙｙｙｙｙｙｑ；咖啡醛：；松柏醛：；；Ａ：ＳｉｎａｏｌｏＡ；對－香豆醛：ｃｏｕｍａｒａｌｄｅｈｄｅＣａｆｆｅｏｌａｌｄｅｈｄｅＣｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｄｅ５５ｈｄｒｏｘｃｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｄｅ－Ｃ－　－羥基松柏醛：－ｐｙｐｙｙｙｙｙｙｙ�。粚Γ愣勾迹�；松柏醇：；；芥子醇：芥子醛：ＳｉｎａａｌｄｅｈｄｅｃｏｕｍａｒｌａｌｃｏｈｏｌＣｏｎｉｆｅｒｌａｌｃｏｈｏｌ５５ｈｄｒｏｘｃｏｎｉｆｅｒｌａｌｃｏｈｏｌＳｉｎａｌａｌ－　　－羥基松柏醇：－　�。穑穑穑�；過氧化物酶／漆酶：／；Ｈ型木質(zhì)素：ＨｃｏｈｏｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅｌａｃｃａｓｅｌｉｎｉｎ；Ｇ型木質(zhì)素：Ｇｌｉｎｉｎ；Ｓ型木質(zhì)素：Ｓｌｉｎｉｎ．　　　ｇｇｇ

其中Ｓ另外半纖維素、果膠和木聚糖的合成也減少，外層木質(zhì)部表現(xiàn)出橙棕５０％，ｌｉｎｉｎ比Ｇｌｉｎｉｎ減少得更多，－－ｇｇ

９］

。Ｃ并且伴隨著纖維素比例的增加，改善了制漿特性［木質(zhì)色且著色不均，ＣＲ下調(diào)的煙草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）　

素含量降低，而Ｃ轉(zhuǎn)錄和代謝研究表明木質(zhì)素合成途徑與其他代ＡＤ下調(diào)植株的木質(zhì)素中含有更多的醛類物質(zhì)，

１０］

。玉米（，謝途徑相關(guān)聯(lián)［Ｚｅａ　ｍａｓ）ＣＣＲ１基因插入突變體（Ｚｍｃｃｒ１ＣＣＲ１基因的表達(dá)量只有野生型的３１％，－）ｙ

／其木質(zhì)素含量有所下降且結(jié)構(gòu)明顯改變，并且消化性能提高，但未影響植Ｈ－ｌｉｎｉｎ含量明顯下降，ＳＧ略有上升，ｇ

１１］

。另外，株的生長發(fā)育［由于苯丙氨酸代謝途徑不僅生成木質(zhì)素，還生成其他的植物次生代謝物，如類黃酮、羥

單寧酸等酚類化合物，因此，可通過降低木質(zhì)素的生物合成來促進(jìn)有益的可溶性酚類化合物生成。在基苯乙烯、

干擾Ｃ中，木質(zhì)素含量降低，同時莖和葉中可溶性酚類物質(zhì)的總ＣＲ基因的轉(zhuǎn)基因番茄（Ｓｏｌａｎｕｍｌｃｏｅｒｓｉｃｕｍ）　ｙｐ組分分析顯示綠原酸和蘆丁等含量增加，果實中酚類物質(zhì)總量沒有增加，但是組分發(fā)生改變，相應(yīng)地提含量增加，

１２］

。高了番茄提取物的抗氧化能力［

將３種肉桂醛（對－香豆醛、松柏醛和芥子醛）還原生成相應(yīng)的３ＣＡＤ催化木質(zhì)素單體生物合成的最后一步，

［３］

種肉桂醇。Ｓ通過Ｒ中Ｃ發(fā)現(xiàn)這些植株莖中催化松ａａｔｈｏｆｆ等１ＮＡｉ下調(diào)柳枝稷（Ｐａｎｉｃｕｍ�。觯椋颍幔簦酰恚粒谋磉_(dá)，ｇ

總木質(zhì)素含量和表皮素含量也明顯降低，且經(jīng)過氫氧化銨預(yù)處理和纖維素酶消柏醛和芥子醛的ＣＡＤ活性下降，

［４］化的研磨樣品釋放出的葡萄糖也多于野生型對照。Ｆ利用Ｒ結(jié)果顯示ｏｒｎａｌé等１ＮＡｉ下調(diào)玉米ＣＡＤ基因表達(dá)，

轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞壁的成分發(fā)生變化，莖的細(xì)胞壁總木質(zhì)素含量未受影響，在不同組織中ＣＡＤ下調(diào)的程度不同，／并且積累了更多的纖維素和木聚糖，而中脈的細(xì)胞壁總木質(zhì)素含量和多糖含量下降，轉(zhuǎn)基因ＳＧ比例稍有下降，植株與野生型相比表型沒有改變，但更容易降解，乙醇產(chǎn)量也較高。Ｒ中的ＮＡｉ下調(diào)亞麻（Ｌｉｎｕｍ�。酰螅椋簦幔簦椋螅螅椋恚酰恚�

１５］

。Ｒ木質(zhì)素前體物質(zhì)含量顯著提高，木質(zhì)素、果膠和半纖維素含量降低，轉(zhuǎn)基因植株的彈性增加［ＣＡＤ后，ＮＡｉ［６］

。還有研究將擬南下調(diào)Ｃ植株生長發(fā)育正常，木質(zhì)素含量未受影響，僅ＧＡＤ１的轉(zhuǎn)基因煙草，ｌｉｎｉｎ略有減少１－ｇ

的突變體和Ｃ芥２種ＣＡＤ基因（ＣＡＤ�。煤停茫粒摹。模茫遥钡耐蛔凅w雜交后發(fā)現(xiàn)其木質(zhì)素含量比野生型減少了

１７］

。木質(zhì)素結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，但植株嚴(yán)重矮化并伴有雄性不育癥狀［３１％，

綜上所述，利用Ｒ在多種植物中，可以通過降低木質(zhì)素合成途徑中相應(yīng)酶的表ＮＡｉ技術(shù)并結(jié)合轉(zhuǎn)基因方法，達(dá)而獲得木質(zhì)素含量降低或者木質(zhì)素組成改變的轉(zhuǎn)基因植物。Ｒ在ｍＲＮＡｉ是由雙鏈ＲＮＡ分子介導(dǎo)的、ＮＡ水平關(guān)閉相應(yīng)基因表達(dá)的過程。因為Ｒ抑制基因表達(dá)效率高，，已被廣泛應(yīng)用于真核生物基因功ＮＡｉ技術(shù)簡單易行，

１８］

。能的研究［

多年生黑麥草（是禾本科黑麥草屬（植物，是優(yōu)良的牧草和草坪草，但自交不親和，Ｌｏｌｉｕｍ　ｅｒｅｎｎｅ）Ｌｏｌｉｕｍ）ｐ傳統(tǒng)育種困難而復(fù)雜。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為黑麥草遺傳改良的有力工具，可通過ＲＮＡｉ

４］

。方法和轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得木質(zhì)素含量降低的黑麥草［

１９］

，本研究在本實驗室已建立的多年生黑麥草轉(zhuǎn)化體系上［優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法，通過根癌農(nóng)桿菌（Ａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇ

介導(dǎo)的Ｒ降低多年生黑麥草中Ｃ以期獲得低木質(zhì)素含量的多年生黑ＮＡｉ技術(shù)，ＣＲ、ＣＡＤ基因表達(dá)，ｔｕｍｅａｃｉｅｎｓ）ｆ為進(jìn)一步培育高消化利用率的多年生黑麥草提供種質(zhì)資源。麥草新材料，１　材料與方法１．１　材料

，多年生黑麥草品種“雅晴”由百綠草業(yè)公司惠贈。本實驗在中國科學(xué)院成都生物研究所于２０１０年９月至２０１２年４月期間進(jìn)行并完成。根癌農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５由本實驗室保存。植物表達(dá)載體ｐ２３５５由中國科學(xué)院成都生物研究所馬欣榮實驗室在ｐ外源基因由多克隆位點區(qū)插入；中間載體ｐｉｎｔ由四ＣＡＭＢＩＡ２３０１基礎(chǔ)上構(gòu)建，ＳＫ－川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃維藻博士惠贈。載體示意圖見圖２。１．２�。茫粒暮停茫茫一蚱蔚姆蛛x克隆

））根據(jù)Ｎ登錄號：和Ｃ登錄號：基因ｃ選取其ＣＢＩ中的黑麥草ＣＡＤ（ＡＦ４７２５９１．１ＣＲ（ＡＦ２７８６９８．１ＤＮＡ序列，中約２應(yīng)用Ｐ分別設(shè)計Ｃ反向目的片段的上下游２對引物（表００～３００ｂｒｉｍｅｒ６．０軟件，ＡＤ和ＣＣＲ正、�。鸬钠危�，正向片段和反向片段引物的擴增序列相同，而酶切位點不同，以使目的片段定向插入載體中。１

預(yù)期Ｃ加酶切位點１共計２加酶切位點１共計ＡＤ片段長度２５６ｂ２ｂ６８ｂＣＣＲ片段長度１９４ｂ２ｂｐ，ｐ，ｐ；ｐ，ｐ，２０６ｂｐ。

第２２卷第５期草業(yè)學(xué)報２０１３年７５

圖２　載體結(jié)構(gòu)簡圖Ｆｉ．２�。裕瑁澹悖幔螅螅澹簦簦澹铮妫觯澹悖簦铮颍蟆　　。�

ｉｎｔ結(jié)構(gòu)簡圖。ｐｉｎｔｓｉｍｌｉｆｉｅｄｄｉａｒａｍ．Ｂ：植物表達(dá)載體ｐｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｏｆｔｈｅｅｘｒｅｓＳＫＳＫ２３５５表達(dá)盒示意圖。Ｔｌａｎｔ�。粒褐虚g載體ｐ－－　　　　　　　　－ｐｇｐｐｐｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｉＣＡＤ和ｐｉＣＣＲ干擾片段表達(dá)盒示意圖。ＴｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｉＣＡＤａｎｄｉＣＣＲｉｎ２３５５．Ｃ：重組植物表達(dá)載體ｐ２３２３ｌａｎｔ２３２３　�。　　　。　。。穑穑穑穑穑簦澹颍妫澹颍澹睿悖澹妫颍幔恚澹睿簦澹颍澹螅螅椋铮睿悖幔螅螅澹簦簦澹洌椋幔颍幔恚　　　。纾穑纭�

表１　用于擴增Ｃ反向片段的寡核苷酸引物ＡＤ、ＣＣＲ正、

Ｔａｂｌｅ１�。樱澹酰澹睿悖澹螅铮妫铮欤椋铮睿酰悖欤澹铮簦椋洌澹颍椋恚澹颍螅酰螅澹洌妫铮颍幔恚欤椋妫椋悖幔簦椋铮睿铮妫茫粒模茫茫遥妫颍幔恚澹睿簦蟆　　　　　　　　。瘢纾穑穑�

引物名稱Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ　

ｃａｄ１－ｃａｄ２－ｃａｄ３－ｃａｄ４－ｃｃｒ１－ｃｃｒ２－ｃｃｒ３－ｃｃｒ４－

引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｕｅｎｃｅｓ　ｑ

ＧＧＡＴＣＣＧＡＣＧＡＴＧＴＧＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣ�。牵粒牵茫牵裕茫粒牵牵牵裕牵牵牵牵茫粒牵粒粒牵裕浴。牵粒牵茫裕茫牵粒茫牵粒裕牵裕牵粒茫牵粒裕茫粒粒牵牵裕牵茫裕谩。牵粒粒裕裕茫裕牵粒牵茫牵裕茫粒牵牵牵裕牵牵牵牵茫粒牵粒粒牵裕浴。牵牵粒裕茫茫粒粒牵茫茫牵粒茫茫裕茫茫裕茫牵粒茫裕粒裕牵粒裕牵谩。粒粒牵茫裕裕牵茫茫牵粒裕牵牵粒茫牵粒茫牵裕牵粒粒茫粒茫谩。牵粒牵茫裕茫粒粒牵茫茫牵粒茫茫裕茫茫裕茫牵粒茫裕粒裕牵粒裕牵谩。牵粒粒裕裕茫牵茫茫牵粒裕牵牵粒茫牵粒茫牵裕牵粒粒茫粒茫谩�

酶切位點Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅ　

擴增片段Ａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒａｍｅｎｔｓ　ｐｇ

ＢａｍＨＩ　�。龋椋睿洌桑桑伞。樱幔悖伞　。牛悖铮遥伞。拢幔恚龋伞　。龋椋睿洌桑桑伞。樱幔悖伞　。牛悖铮遥伞�

）。Ｃ預(yù)期長度２ＣＡＤ正向片段（６８ｂＡＤｆｏｒ　－ｐ）ｗａｒｄｆｒａｍｅｎｔ（ｅｘｅｃｔｅｄｌｅｎｔｈ２６８ｂ．　　�。纾穑纾稹＃妙A(yù)期長度２ＣＡＤ反向片段（６８ｂＡＤｒｅ�。穑觯澹颍螅澹妫颍幔恚澹睿簦ǎ澹澹悖簦澹洌欤澹睿簦瑁玻叮福猓　　。纾穑纾�。Ｃ預(yù)期長度２ＣＣＲ正向片段（０６ｂＣＲｆｏｒ　－ｐ））ｗａｒｄｆｒａｍｅｎｔ（ｅｘｅｃｔｅｄｌｅｎｔｈ２０６ｂ．　　�。纾穑纾�。Ｃ預(yù)期長度２ＣＣＲ反向片段（０６ｂＣＲｒｅ�。穑觯澹颍螅澹妫颍幔恚澹睿簦ǎ澹澹悖簦澹洌欤澹睿簦瑁玻埃叮猓　　。纾穑纾�

　下劃線部分為酶切位點。

ｈｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｓｉｔｅｓｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｍｅｓ．　Ｔ　　　　　　�。�

）用Ｒ反轉(zhuǎn)錄成ｃ作為擴增目的片段ＮＡ，Ｔ－ＰＣＲ試劑盒（ＴａＫａＲａＤＮＡ，　　提取新鮮的野生型黑麥草葉片總Ｒ

。擴增條件為的模板。用引物ｃ表１）ａｄ１和ｃａｄ２、ｃｃｒ１和ｃｃｒ２分別ＰＣＲ擴增出ＣＡＤ和ＣＣＲ的正向片段（－－－－；，，，（；。擴增產(chǎn)物經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳，切下目９４℃５ｍｉｎ９４℃４５ｓ５５℃４５ｓ７２℃４５ｓ３５個循環(huán)）７２℃７ｍｉｎ（）上海生工）回收后與ｐ連接，篩選重組子并測序（上海的條帶用ＤＮＡ　ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔＴａＫａＲａＭＤ１９　�。暂d體（，）生工）測序結(jié)果用Ｄ版本５．軟件進(jìn)行分析。ＮＡＭＡＮ（２．２

以含有Ｃ分別以ｃＡＤ或ＣＣＲ正向片段的重組ｐａｄ３和ｃａｄ４、ｃｃｒ３和ｃｃｒ４為引物，ＭＤ１９－Ｔ載體為模板，－－－－，表１）再分別克隆到ｐ篩選重組子，酶切驗證并測序分ＰＣＲ擴增出ＣＡＤ和ＣＣＲ的反向片段（ＭＤ１９－Ｔ載體中，析。

１．３�。穑椋茫粒暮停穑椋茫茫抑参锉磉_(dá)載體構(gòu)建２３２３－－

含有正向目的片段的重組ｐ分別回收小片段，與經(jīng)相同酶ＭＤ１９ａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩＩ雙酶切，－Ｔ載體分別經(jīng)Ｂ　　切的中間載體ｐ篩選重組子并酶切驗證。再將含Ｃｉｎｔ連接，ＡＤ或ＣＣＲ反向片段的重組ｐＳＫＭＤ１９－－Ｔ載體分別用Ｅ回收小片段分別插入已經(jīng)含有Ｃ篩ｃｏＲＩ和ＳａｃＩ雙酶切后，ＡＤ或ＣＣＲ正向片段的重組中間載體相應(yīng)位點，　酶切驗證。分別獲得含有干擾片段的中間載體ｐ具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的干擾片段分選重組子，ｉＣＡＤ和ｐｉＣＣＲ，ＳＫＳＫ－－別稱為ｉＣＡＤ和ｉＣＣＲ。

將重組中間載體分別用Ｂ分別獲得ｉａｍＨＩ和ＳａｃＩ雙酶切后，ＣＡＤ或ｉＣＣＲ目的片段。將目的片段分別插　　

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