本文關(guān)鍵詞：鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶原核基因工程菌的構(gòu)建與表達(dá)條件優(yōu)化

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【摘要】：新橙皮苷在植物內(nèi)的含量較低,其同分異構(gòu)體橙皮苷在植物體內(nèi)含量較高。兩者的結(jié)構(gòu)上的差異僅僅是黃酮環(huán)上取代基上葡萄糖與鼠李糖的糖苷鍵不同。本研究希望利用生物轉(zhuǎn)化法將橙皮苷轉(zhuǎn)化為新橙皮苷。本文通過構(gòu)建一株原核工程菌來表達(dá)鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶,該酶可以催化鼠李糖與葡萄糖通過1,2糖苷鍵連接,以此來合成新橙皮苷,并且對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,還對工程菌的產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。主要的研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.原核工程菌的構(gòu)建及表達(dá):從Lactobacillus plantarum WCFS1的基因組中擴(kuò)增得到編碼鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的glycosyltransferase(rhamnosyltransferase),family 2(GT2)基因,將該目的基因與表達(dá)載體pET-DsbA連接,得到重組表達(dá)載體pET-DsbA-GT2。將表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21(DE3),成功構(gòu)建得到了原核表達(dá)工程菌BL21(pET-DsbA-GT2);采用誘導(dǎo)劑IPTG對工程菌BL21(pET-DsbA-GT2)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),GT2與DsbA成功的融合表達(dá),得到了56.7 kDa左右大小的融合蛋白(其中,GT2的大小為35.7 kDa,DsbA的大小為21 kDa)。表達(dá)方式為部分包涵體、部分可溶性表達(dá)。2.鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究:通過分離純化分別得到了包涵體蛋白酶(GT2-1)、可溶性蛋白酶(GT2-2)兩種鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶。酶活測定結(jié)果顯示GT2-1的比活力為0.41 U/mg,遠(yuǎn)低于可溶性目的蛋白GT2-2的1.92 U/mg。酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果:GT2-1、GT2-2兩種酶的最適反應(yīng)溫度38-40℃,最適pH值為6.0-6.5;GT2-1、GT2-2在20-40℃處理1 h后的酶活仍能達(dá)到90%以上,當(dāng)溫度超過40℃時,GT2-1的酶活隨著溫度的升高迅速降低,當(dāng)溫度達(dá)到70℃時便完全失去酶活,GT2-2溫度達(dá)到80℃才完全失去酶活;GT2-1、GT2-2在pH值在5-10這個范圍內(nèi)均具有較好的穩(wěn)定性。3.重組菌BL21(pET-DsbA-GT2)表達(dá)條件的優(yōu)化:以表達(dá)系數(shù)F和表達(dá)量Q為表征量,對BL21(pET-DsbA-GT2)重組菌的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。最后得到的最優(yōu)表達(dá)條件為:誘導(dǎo)時機(jī)選擇為培養(yǎng)10-12 h后進(jìn)行誘導(dǎo);誘導(dǎo)時間為5-6h;誘導(dǎo)溫度為30℃;誘導(dǎo)劑IPTG的最終濃度為100μg/mL;搖床轉(zhuǎn)速為160 rpm。
【關(guān)鍵詞】：新橙皮苷 橙皮苷 鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶 基因克隆 酶學(xué)性質(zhì) 分離純化
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;TQ925
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-10
• 第1章 緒論10-25
• 1.1 引言10-11
• 1.2 橙皮苷簡介11-17
• 1.2.1 橙皮苷的理化性質(zhì)11-12
• 1.2.2 橙皮苷的應(yīng)用12-14
• 1.2.3 橙皮苷的改性研究進(jìn)展14-17
• 1.3 新橙皮苷簡介17-20
• 1.3.1 新橙皮苷的來源17-19
• 1.3.2 新橙皮苷的應(yīng)用19-20
• 1.4 糖基轉(zhuǎn)移酶研究進(jìn)展20-22
• 1.4.1 植物次生合成代謝中糖基化的作用21
• 1.4.2 糖基轉(zhuǎn)移酶基因的研究進(jìn)展21-22
• 1.5 本文的研究意義和內(nèi)容22-25
• 1.5.1 研究的意義22-23
• 1.5.2 研究的內(nèi)容23-25
• 第2章 鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶原核基因工程菌的構(gòu)建與表達(dá)25-45
• 2.1 引言25-27
• 2.2 實驗材料27-31
• 2.2.1 菌株與質(zhì)粒27
• 2.2.2 主要試劑與酶27-28
• 2.2.3 主要儀器28
• 2.2.4 培養(yǎng)基28-29
• 2.2.5 主要溶液配制29-30
• 2.2.6 引物30-31
• 2.3 實驗方法31-38
• 2.3.1 菌株活化31
• 2.3.2 DH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞制備31-32
• 2.3.3 GT2基因的擴(kuò)增32-33
• 2.3.4 p UCm-T-GT2克隆載體的構(gòu)建33-34
• 2.3.5 重組質(zhì)粒（p UCm-T-GT2）轉(zhuǎn)化至DH5α34
• 2.3.6 重組質(zhì)粒（p UCm-T-GT2）的檢測34-35
• 2.3.7 重組表達(dá)載體（p ET-Dsb A-GT2）的構(gòu)建35-37
• 2.3.8 重組BL21(p ET- Dsb A-GT2) 菌株的構(gòu)建37
• 2.3.9 BL21（p ET- Dsb A-GT2）重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)37
• 2.3.10 SDS-PAGE電泳檢測誘導(dǎo)表達(dá)37-38
• 2.4 結(jié)果與討論38-43
• 2.4.1 GT2基因的擴(kuò)增38-39
• 2.4.2 GT2基因的測序結(jié)果39-40
• 2.4.3 p UCm-T-GT2克隆載體的驗證40
• 2.4.4 p ET-Dsb A質(zhì)粒提取結(jié)果40-41
• 2.4.5 重組表達(dá)載體p ET-Dsb A-GT2驗證41-42
• 2.4.6 重組菌株BL21誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果42-43
• 2.5 本章小結(jié)43-45
• 第3章 鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的體外復(fù)性、純化及其性質(zhì)的研究45-63
• 3.1 引言45-46
• 3.2 實驗材料46-49
• 3.2.1 菌株46
• 3.2.2 主要試劑46-47
• 3.2.3 主要儀器47-48
• 3.2.4 培養(yǎng)基48-49
• 3.3 實驗方法49-55
• 3.3.1 菌株活化49
• 3.3.2 鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的分離與純化49-51
• 3.3.3 鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶酶活測定51-54
• 3.3.4 鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)性質(zhì)的研究54-55
• 3.4 結(jié)果與討論55-61
• 3.4.1 鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶純化結(jié)果55-56
• 3.4.2 鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶酶活檢測結(jié)果56-57
• 3.4.3 鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果57-61
• 3.5 本章小結(jié)61-63
• 第4章 重組工程菌BL21(p ET- Dsb A-GT2) 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化63-74
• 4.1 引言63
• 4.2 實驗材料63-64
• 4.2.1 菌株63
• 4.2.2 主要試劑63-64
• 4.2.3 主要儀器64
• 4.2.4 培養(yǎng)基64
• 4.2.5 主要溶液配制64
• 4.3 實驗方法64-68
• 4.3.1 菌株活化64-65
• 4.3.2 目的蛋白表達(dá)形式的分析方法65-66
• 4.3.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化66-68
• 4.4 結(jié)果與討論68-72
• 4.4.1 誘導(dǎo)時機(jī)的優(yōu)化68-69
• 4.4.2 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化69
• 4.4.3 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化69-70
• 4.4.4 誘導(dǎo)劑IPTG濃度的優(yōu)化70-71
• 4.4.5 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化71-72
• 4.5 本章小結(jié)72-74
• 第5章 結(jié)論與展望74-76
• 5.1 總結(jié)74-75
• 5.2 展望75-76
• 致謝76-77
• 參考文獻(xiàn)77-85
• 附錄85-86
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果86

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1108799