發(fā)布時間：2017-10-28 06:24

  本文關(guān)鍵詞：高產(chǎn)纖維素酶黑曲霉菌基因克隆及表達(dá)研究

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【摘要】：纖維素是地球上最豐富的可再生資源,可利用率低,有的直接采用焚燒的方法,引起嚴(yán)重的環(huán)境污染。在自然環(huán)境中存在大量能夠降解纖維素的微生物,因此可利用微生物對纖維素進(jìn)行降解,產(chǎn)生一系列有用的副產(chǎn)物,還能減少對環(huán)境的污染。而纖維素的水解需要纖維素酶,纖維素被內(nèi)切酶和外切酶水解成纖維二糖和低聚糖后,由纖維二糖酶將以上產(chǎn)物水解生成葡萄糖。纖維二糖酶用途廣泛,不僅能應(yīng)用于生物燃料,解決緊缺的燃料問題,而且可應(yīng)用于食品、化工、生物制造等諸多工業(yè)生產(chǎn)中。因此對纖維二糖酶的研究具有重要的理論和實(shí)用價值。本論文的主要結(jié)果如下：1.以紫外誘變獲得的高產(chǎn)纖維素酶黑曲霉C112菌株RNA為模板,采用RT-PCR技術(shù)克隆黑曲霉C112的纖維二糖酶基因bgl(GenBank登錄號：KP307454)；該基因全長2934bp,含有非編碼序列,編碼860個氨基酸,等電點(diǎn)為4.70,蛋白質(zhì)理論分子量為93.33kD,核酸序列與數(shù)據(jù)庫的Aspergillus niger(GenBank登錄號JX982101.1)同源性達(dá)到了99%；其中A644個、T666個、G834個、C790個,G+C含量為55.35%。酸性氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為99,堿性氨基酸(Arg+Lys)為64,表明其為酸性蛋白質(zhì)。20種氨基酸中甘氨酸(Gly)含量最高,為10.7%：丙氨酸(Ala)次之,為9.07%。2.以pPIC9K作為黑曲霉纖維二糖酶基因的表達(dá)載體,篩選得到陽性克��；采用化學(xué)轉(zhuǎn)化手段將帶有目的基因的pPIC9K質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母SMD1168中；通過SDS-PAGE蛋白電泳檢測到大小為93.3 kD的蛋白條帶,與預(yù)期目的蛋白大小相符。3.對重組畢赤酵母菌產(chǎn)纖維二糖酶進(jìn)行分析,以YG為培養(yǎng)基,每隔12h取發(fā)酵上清液,測定纖維二糖酶酶活力,發(fā)酵時間為96 h時纖維二糖酶酶活力最高,纖維二糖酶酶活力達(dá)到30.37 U/mL；纖維二糖酶最適反應(yīng)溫度為50℃,最適反應(yīng)pH為5.0。用1 mM Mg2+處理之后纖維二糖酶的相對活力最高,相對酶活力為110.2±6.5%；用1 mM Mg2、K+、Ca2+和Pb2+處理都能夠有效的增加酶的活力,1mM Na+和Fe2+對酶活沒什么影響,而1mM Fe3+、Li+、Zn2+、Cu2+、 Mn2+和Ag+對纖維二糖酶具有抑制作用�；瘜W(xué)試劑2 mg/mL SDS和10mM EDTA對纖維二糖酶酶活影響不大,1 mM β-mercaptoethanol能夠有效的提高纖維二糖酶的酶活力。說明一定的金屬離子能夠有效提高纖維二糖酶的活力。4.利用產(chǎn)纖維二糖酶的重組畢赤酵母,確定基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源、氮源,并在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)上,采用單因素試驗(yàn)法從誘導(dǎo)時間、接種量、pH值、甲醇濃度考察發(fā)酵條件對纖維二糖酶活力、蛋白表達(dá)量和菌體生物量的影響,利用響應(yīng)面分析法確定關(guān)鍵影響因子的最佳參數(shù)。優(yōu)化后的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源為麩皮2.5%(W/V),最佳氮源為玉米漿粉3.0%(W/V)。獲得最佳發(fā)酵條件為：誘導(dǎo)時間96 h、接種量為15%(V/V)、初始pH值5.0、甲醇濃度1.0%(V/V)。在此最佳發(fā)酵條件下,纖維二糖酶的理論酶活最大值達(dá)到32.80 U/mL。驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基纖維二糖酶活為(32.24±0.51)U/mL,外源蛋白表達(dá)量為(131.57±1.52)mg/L,與預(yù)測值接近。5.在搖床優(yōu)化的基礎(chǔ)上,利用5L發(fā)酵罐對重組畢赤酵母產(chǎn)纖維二糖酶的發(fā)酵過程進(jìn)行了放大,并且該菌株在5L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵的數(shù)據(jù)為參考,結(jié)合數(shù)學(xué)推導(dǎo),建立了分批發(fā)酵生產(chǎn)纖維二糖酶的菌體生成,纖維二糖酶的合成以及基質(zhì)消耗動力學(xué)模型,如下：(1)菌體生長動力學(xué)模型(2)基質(zhì)消耗動力學(xué)模型(3)纖維二糖酶合成動力學(xué)模型所建模型基本能夠描述重組畢赤酵母產(chǎn)纖維二糖酶的動態(tài)過程,可以為以后的進(jìn)一步的工業(yè)放大實(shí)驗(yàn)提供理論參考。
【關(guān)鍵詞】：黑曲霉 纖維二糖酶 重組畢赤酵母 響應(yīng)面 發(fā)酵動力學(xué)
【學(xué)位授予單位】：中南林業(yè)科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;Q55
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 縮略詞表9-15
• 1 緒論15-27
• 1.1 纖維素酶(CELLULASE)15-17
• 1.2 纖維二糖酶17-20
• 1.2.1 纖維二糖酶的理化性質(zhì)17-18
• 1.2.2 纖維二糖酶的分類18
• 1.2.3 纖維二糖酶的作用機(jī)制18-19
• 1.2.4 纖維二糖酶的底物特異性19
• 1.2.5 纖維二糖酶的活性測定19-20
• 1.3 纖維二糖酶的應(yīng)用20-21
• 1.3.1 在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用20
• 1.3.2 在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用20-21
• 1.3.3 纖維二糖酶的其它應(yīng)用21
• 1.4 纖維二糖基因工程研究進(jìn)展21-23
• 1.4.1 纖維二糖酶基因的克隆21-22
• 1.4.2 纖維二糖酶基因的原核表達(dá)22-23
• 1.4.3 纖維二糖酶基因的真核表達(dá)23
• 1.5 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)23-25
• 1.5.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)23-24
• 1.5.2 畢赤酵母表達(dá)載體24-25
• 1.5.3 畢赤酵母發(fā)酵優(yōu)化25
• 1.6 研究的目的及內(nèi)容25-27
• 1.6.1 研究目的、意義25-26
• 1.6.2 研究內(nèi)容26-27
• 2 纖維二糖酶基因的克隆及鑒定27-38
• 2.1 材料27-29
• 2.1.1 菌種27
• 2.1.2 儀器設(shè)備27
• 2.1.3 酶與試劑27-28
• 2.1.4 培養(yǎng)基28
• 2.1.5 溶液配制28-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-34
• 2.2.1 黑曲霉C112總RNA的提取29
• 2.2.2 cDNA單鏈的合成29-30
• 2.2.3 RT-PCR擴(kuò)增30-31
• 2.2.4 PCR產(chǎn)物純化回收31
• 2.2.5 PCR產(chǎn)物與載體的連接31-32
• 2.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化32
• 2.2.7 陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定32-34
• 2.3 結(jié)果與分析34-37
• 2.3.1 黑曲霉C112總RNA的提取及纖維二糖酶基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果34-35
• 2.3.2 重組克隆的藍(lán)白斑篩選35
• 2.3.3 重組克隆的鑒定35-36
• 2.3.4 克隆基因序列分析36-37
• 2.4 小結(jié)與討論37-38
• 3 纖維二糖酶基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建38-45
• 3.1 材料38-39
• 3.1.1 菌種與質(zhì)粒38
• 3.1.2 儀器設(shè)備38
• 3.1.3 酶與試劑38-39
• 3.1.4 質(zhì)粒pPIC9K的物理圖譜39
• 3.1.5 培養(yǎng)基39
• 3.1.6 溶液配制39
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法39-42
• 3.2.1 纖維二糖酶基因的回收39-40
• 3.2.2 真核表達(dá)載體pPIC9K質(zhì)粒的回收40
• 3.2.3 纖維二糖酶基因和真核表達(dá)載體質(zhì)粒的連接40-41
• 3.2.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α41
• 3.2.5 重組轉(zhuǎn)化子的鑒定41-42
• 3.3 結(jié)果與分析42-44
• 3.3.1 重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pPIC9K的雙酶切鑒定42-43
• 3.3.2 重組表達(dá)載體PCR鑒定43
• 3.3.3 重組表達(dá)載體的雙酶切鑒定43-44
• 3.4 小結(jié)與討論44-45
• 4 纖維二糖酶基因電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母45-54
• 4.1 材料45-47
• 4.1.1 菌種與試劑45
• 4.1.2 儀器設(shè)備45
• 4.1.3 培養(yǎng)基45-46
• 4.1.4 溶液配制46-47
• 4.2 試驗(yàn)方法47-50
• 4.2.1 重組質(zhì)粒pPIC9K-bg1線性化47
• 4.2.2 畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞的制備47-48
• 4.2.3 畢赤酵母的化學(xué)轉(zhuǎn)化48
• 4.2.4 重組酵母PCR鑒定和測序鑒定48-49
• 4.2.5 SDS-PAGE檢測目的蛋白49-50
• 4.3 結(jié)果與分析50-52
• 4.3.1 重組酵母菌PCR檢測結(jié)果50-51
• 4.3.2 SDS-PAGE蛋白電泳檢測結(jié)果51-52
• 4.4 小結(jié)與討論52-54
• 5 重組畢赤酵母產(chǎn)酶活性測定54-61
• 5.1 材料與方法54-55
• 5.1.1 菌種54
• 5.1.2 儀器與設(shè)備54
• 5.1.3 培養(yǎng)基54
• 5.1.4 溶液配制54-55
• 5.2 試驗(yàn)方法55-57
• 5.2.1 粗酶液的制備55
• 5.2.2 重組畢赤酵母菌纖維二糖酶活力測定55-56
• 5.2.3 纖維二糖酶最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性的測定56
• 5.2.4 纖維二糖酶最適反應(yīng)pH和pH溫度性的測定56
• 5.2.5 金屬離子和化學(xué)試劑對酶活力的影響56-57
• 5.3 結(jié)果與分析57-60
• 5.3.1 重組畢赤酵母菌纖維二糖酶活性測定結(jié)果57
• 5.3.2 溫度對纖維二糖酶酶活力和穩(wěn)定的影響57-58
• 5.3.3 pH對纖維二糖酶酶活力和穩(wěn)定的影響58-59
• 5.3.4 金屬離子和化學(xué)試劑對纖維二糖酶酶活力的影響59-60
• 5.4 小結(jié)與討論60-61
• 6 重組畢赤酵母產(chǎn)纖維二糖酶發(fā)酵工藝優(yōu)化61-72
• 6.1 材料61-62
• 6.1.1 菌種與試劑61
• 6.1.2 儀器與設(shè)備61
• 6.1.3 培養(yǎng)基61-62
• 6.1.4 產(chǎn)物的測定62
• 6.2 試驗(yàn)方法62-63
• 6.2.1 重組畢赤酵母菌株種子液的培養(yǎng)62
• 6.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)62-63
• 6.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化63
• 6.3 結(jié)果與分析63-71
• 6.3.1 纖維二糖酶標(biāo)準(zhǔn)曲線63
• 6.3.2 培養(yǎng)基發(fā)酵工藝條件的確定63-67
• 6.3.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)條件67-71
• 6.3.4 最佳工藝條件預(yù)測與試驗(yàn)驗(yàn)證71
• 6.4 小結(jié)與討論71-72
• 7 重組畢赤酵母產(chǎn)纖維二糖酶發(fā)酵動力學(xué)研究72-81
• 7.1 材料與方法72-73
• 7.1.1 菌種與試劑72
• 7.1.2 儀器與設(shè)備72-73
• 7.1.3 培養(yǎng)基73
• 7.2 試驗(yàn)方法73-75
• 7.2.1 斜面種子培養(yǎng)73
• 7.2.2 搖瓶種子培養(yǎng)73
• 7.2.3 分批發(fā)酵73
• 7.2.4 分析方法73-75
• 7.2.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的測定75
• 7.3 結(jié)果與分析75-79
• 7.3.1 重組畢赤酵母產(chǎn)纖維二糖酶發(fā)酵過程中代謝變化規(guī)律75-76
• 7.3.2 分批發(fā)酵動力學(xué)模型的建立76-79
• 7.4 小結(jié)與討論79-81
• 8 結(jié)論與展望81-84
• 8.1 結(jié)論81-82
• 8.2 展望82-84
• 9 創(chuàng)新84-85
• 參考文獻(xiàn)85-93
• 附錄93-94
• 攻讀學(xué)位期間的主要學(xué)術(shù)成果94-95
• 致謝95

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本文編號：1107029