本文關鍵詞：黏液型銅綠假單胞菌耐藥特征和耐藥株相關基因型分析

  更多相關文章： 黏液型銅綠假單胞菌 耐藥 基因型 耐碳青霉烯類 亞胺培南 美羅培南 金屬酶

【摘要】：背景:銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是引起院內感染主要的革蘭陰性桿菌,是人體最重要的條件致病菌之一,它可引起機體多系統,多臟器或多部位感染。假單胞菌感染的患者具有抗生素用藥史周期長、復雜的特點,臨床治療難度極大。近年來,隨著各種器械性和侵入性治療手段的使用及抗菌藥濫用,導致患者銅綠假單胞菌感染率及耐藥率顯著上升,如何有效治療耐藥的銅綠假單胞菌,是當今亟待解決的難題之一。研究發(fā)現根據菌落的形態(tài)特點,銅綠假單胞菌被劃分為黏液和非黏液兩種類型。銅綠假單胞菌的黏液化與生物膜形成有關,研究表明黏液型菌株比非黏液型定植更持久,感染更不易清除。此外,黏液型銅綠假單胞菌多分離于慢性、持續(xù)性感染患者,且黏液型銅綠假單胞菌的分離率遠低于非黏液型。銅綠假單胞菌不同類型間經常會發(fā)生互相轉化,黏液型有時可轉變?yōu)榉丘ひ盒?特別對于新轉變的黏液型容易轉變?yōu)榉丘ひ盒汀８腥境掷m(xù)發(fā)展,轉變成黏液型的菌株很難恢復成非黏液型。銅綠假單胞菌長期感染機體或長期在機體內潛伏容易產生耐藥性,常規(guī)抗生素則很難將其徹底清除,當患者抵抗力降低很容易導致疾病發(fā)生。研究發(fā)現黏液型銅綠假單胞菌分泌的類似莢膜樣物質,可與鄰近細菌、血小板及纖維蛋白等聚集形成細菌生物膜,從而導致細菌銅綠假單胞菌不易與抗菌藥直接接觸而產生耐藥性。此外,銅綠假單胞菌被膜阻礙機體免疫細胞或抗體與細菌的接觸,導致細菌不易被清除。銅綠假單胞菌是一種特殊的菌株,容易對臨床常用的多種抗生素產生耐藥性,它的耐藥機制非常復雜,涉及包括主動外排系統障礙、產生滅活酶或修飾酶及外膜滲透性降低等。外排系統通常借助細胞內的Mex B、Mex D和Mex E蛋白識別各種抗生素,然后抗生素與胞內的Mex A、Mex B和Opr M形成膜間運輸通道,借助外膜Opr M、Opr J和Opr N形成通道將抗生素排出,進而導致機體對抗生素耐藥。有報道指出抗菌藥物的廣泛使用可刺激細菌耐藥基因發(fā)生改變或產生新的耐藥基因,外膜蛋白Opr D2孔道是碳青霉烯類快速進入銅綠假單胞菌的綠色通道,Opr D2缺失或低表達常是導致銅綠假單胞菌對碳青霉烯類耐藥的重要原因。碳青霉烯類抗生素是治療耐藥革蘭陰性桿菌感染的最有效的藥物之一,它也是防護機體損傷的最后防線。當前,碳青霉烯類抗生素是臨床上治療耐藥銅綠假單胞菌最常見的有效藥物,然而,隨著碳青霉烯類抗生素在治療銅綠假單胞菌的廣泛使用,它對銅綠假單胞菌的耐藥性越來越,有研究發(fā)現銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥率甚至高達46.9%。銅綠假單胞菌的耐碳青霉烯類抗生素機制包括產生碳青霉烯酶、金屬酶、外膜蛋白缺失及主動外排泵等諸多方面。迄今,不同基因型黏液型銅綠假單胞菌與藥物耐藥性的關系及機制,尚不清楚。目的:本文通過探討攜帶不同基因型黏液型銅綠假單胞菌與抗生素耐藥性的相關性,旨在為臨床合理使用抗生素治療攜帶不同基因型黏液型銅綠假單胞菌提供理論參考。方法:菌株來源110株黏液型銅綠假單胞菌,分離于2012年01月-2015年12月來中國人民解放軍202醫(yī)院各科室就診的患者標本。其中,來自痰標本100株,來自膿液及分泌物8株,來源于其他標本2株。菌株鑒定采用常規(guī)鑒定法進行菌株鑒定。標本培養(yǎng)、分離嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行。黏液型銅綠假單胞菌菌落形態(tài)多樣,無色,可見粘稠狀、露滴狀及膠凍狀菌落、菌落邊緣不規(guī)則。用接種環(huán)挑起無金屬光澤、無特殊氣味的菌落,分純后所有菌株鑒定經Vitek2 Compact全自動微生物分析儀鑒定為銅綠假單胞菌,并進行復測。藥敏試驗紙片法測定10種常用抗生素做敏感性試驗。按照CLISM100-22實施。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853。恒溫35℃24h記錄第一次藥敏結果,48h記錄第二次藥敏結果,第72h記錄第三次藥敏結果。敏感性試驗結果參照美國臨床實驗室標準委員會2011標準進行判讀。(藥敏紙片規(guī)格如下:亞胺培南10ug、阿米卡星30ug、妥布霉素10ug、慶大霉素10ug、頭孢吡肟30ug、哌拉西林/他唑巴坦100/10ug、左氧氟沙星5ug、頭孢他啶30ug、環(huán)丙沙星5ug、美羅培南10ug。)PCR方法針對耐碳青霉烯類抗生素不同基因設計特異性引物,避免在3’端產生互補序列和發(fā)夾結構,引物特異性檢驗采用NCBI數據庫中Blast進行匹配分析。采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增Amp C、IMP-1、SPM-1、Opr D、KPC、VIM-1和VIM-2基因。取PCR產物20μl與2ul溴酚藍混勻于2%瓊脂糖凝膠電泳分離,溴化乙錠染色5min后,紫外凝膠成像系統觀察DNA條帶。統計分析采用Spss18.0軟件進行卡方檢驗或Fisher’s精確檢驗,所有統計檢驗均為雙側概率檢驗,P0.05差異有統計學意義。結果:黏液型銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥結果結果發(fā)現24h黏液型銅綠假單胞菌對阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星、頭孢他啶的耐藥率在0~4.5%,而對亞胺培南、美羅培南、頭孢吡肟和環(huán)丙沙星的耐藥率為7.3~9.1%。與24h藥敏結果相比,48h黏液型銅綠假單胞菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率均為13.6%,而對阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星和頭孢他啶的耐藥率在敏感性在6.4~11.8%,差異有統計學意義(P0.05)。與48 h藥敏結果相比,72 h黏液型銅綠假單胞菌對上述抗生素的耐藥率差異不顯著(P0.05)。不同基因型粘液銅綠假單胞菌與耐藥性的關系結果發(fā)現,其中攜帶Amp C陽性基因的菌株有12株(80.00%),攜帶IMP-1陽性基因菌株2株(13.33%),攜帶VIM-1陽性基因菌株有5株(33.33%),攜帶VIM-2陽性基因菌株有9株(60.00%),攜帶Opr D2陽性基因菌株有4株(26.67%),攜帶Opr D2陰性基因為11株(73.33%),攜帶SPM-1陽性基因菌株有4株(26.67%),攜帶KPC陽性基因菌株5株(33.33%)。結論:不同時間檢測的黏液型銅綠假單胞菌對不同抗生素的耐藥率顯著不同,特別對耐碳青霉烯類抗生素亞胺培南和美羅培南存在明顯的耐藥性;黏液型銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗生素機制與Amp C、VIM-2和Opr D2基因密切相關。
【關鍵詞】：黏液型銅綠假單胞菌 耐藥 基因型 耐碳青霉烯類 亞胺培南 美羅培南 金屬酶
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R446.5
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 中英文縮略詞對照表12-13
• 第1章 緒論13-15
• 第2章 材料與方法15-19
• 2.1 菌株來源15
• 2.2 主要試劑15
• 2.3 主要儀器設備15-16
• 2.4 抗菌藥物16
• 2.5 菌株鑒定16
• 2.6 細菌DNA的提取16
• 2.7 引物設計16-18
• 2.8 藥敏試驗18
• 2.9 統計分析18-19
• 第3章 結果19-25
• 3.1 黏液型銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥結果19-20
• 3.2 不同基因型粘液銅綠假單胞菌與耐藥性的關系20-25
• 第4章 討論25-28
• 第5章 結論28-29
• 參考文獻29-34
• 作者簡介及在學期間所取得的科研成果34-35
• 致謝35

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