本文關(guān)鍵詞：小麥重結(jié)晶抑制蛋白IRI基因功能及小麥族IRI基因家族的分子進(jìn)化

  更多相關(guān)文章： 小麥族 抗寒性 重結(jié)晶抑制蛋白基因 進(jìn)化分析

【摘要】：小麥(Triticum aestivum L.)是全球種植面積最大的重要糧食作物之一。小麥耐寒力是限制小麥年產(chǎn)量的最主要因素之一。因此,針對(duì)此現(xiàn)狀,充分利用小麥耐寒基因資源、挖掘新型耐寒基因,并深入剖析其抗寒機(jī)制,對(duì)于改善小麥抗寒力及選育小麥耐冷新品種有著重要的指導(dǎo)意義。重結(jié)晶抑制蛋白(Ice Recrystallization Inhibition protein, IRI)能結(jié)合于冰晶表面抑制冰晶生長和冰的重結(jié)晶,從而提高植物抗寒能力。小麥野生近緣屬種是小麥品種改良的重要基因庫,可為改善小麥抗寒力提供豐富的基因資源。本試驗(yàn)以抗寒性極強(qiáng)的強(qiáng)冬性小麥品種M808為試材,分離鑒定得到6個(gè)IRI基因；以春小麥材料中國春(China Spring, CS)為對(duì)照,研究了不同低溫處理下該IRI基因家族成員間的表達(dá)差異；選擇兩個(gè)代表性IRI基因在煙草中過表達(dá),利用低溫致死試驗(yàn)和相對(duì)電導(dǎo)率等相關(guān)生理指標(biāo)變化驗(yàn)證了該基因的抗凍功能；在小麥野生近緣屬種材料中廣泛分離并成功克隆到22個(gè)IRI基因,并對(duì)該基因家族成員進(jìn)行了分子進(jìn)化分析。主要結(jié)果如下：1.強(qiáng)冬性小麥IRI基因分離、序列比對(duì)及表達(dá)分析本研究分離鑒定得到6個(gè)IRI基因,分別命名為TaIRI3, TaIRI4, TaIRI5, TaIRI6、 TalRI7、 TaIRI8,編碼氨基酸個(gè)數(shù)分別為285、285、285、288、287、287,這些IRI基因以基因家族形式存在,都具有典型IRI蛋白的保守區(qū)特征,包括：N端信號(hào)肽、亮氨酸富集重復(fù)區(qū)(LRR區(qū))、重結(jié)晶抑制區(qū)(IRI區(qū))及若干個(gè)保守半胱氨酸。盡管IRI氨基酸序列的保守性極高,但這些序列之間仍存在差異區(qū)域。根據(jù)差異位點(diǎn)的不同,我們可以把這6個(gè)IRI氨基酸序列分為兩類,TaIRI3、 TalRI4、 TaIRI5為Ⅰ類,TaIRI6、 TaIRI7、 TaIRI8為Ⅱ類。相較于Ⅰ類氨基酸序列,Ⅱ類氨基酸序列分別在173處、285處多出脯氨酸(P)和蘇氨酸(T),另有TaIRI6在172處多出谷氨酰胺(Q)。進(jìn)化分析表明小麥IRI基因編碼的氨基酸序列可聚為3類：TaIRI3、 TaIRI4、 TaIRI5與已發(fā)表的TalRIl聚為一類,為Group I; TaIRI6、 TaIRI7與TaIRI8聚為一類,為Group II; TaIRI2單獨(dú)聚為一類,為GroupIII 。以CS為對(duì)照材料,經(jīng)不同低溫處理后,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)CS和M808的TalRI基因家族成員表達(dá)情況進(jìn)行分析,結(jié)果表明TaIRI基因家族成員表達(dá)存在明顯差異,且在M808的表達(dá)量高于CS。其中,在4℃處理24h后,Group I中TaIRI4表達(dá)量最高,Group II中TaIRI6表達(dá)量最高,推測這兩個(gè)基因分別為兩個(gè)聚類群的主效表達(dá)基因。2.轉(zhuǎn)基因煙草檢測及抗寒功能鑒定將兩個(gè)代表性基因TaIRI4和TaIRI6轉(zhuǎn)入煙草中已經(jīng)得到的T1代植株,通過Southern雜交檢測,轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA所在泳道有清晰可見的條帶,證明目的基因已成功整合到煙草中。通過低溫脅迫試驗(yàn),觀察不同低溫處理下各植株表型變化情況,并測定存活率、電導(dǎo)率、脯氨酸、MDA等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草長勢明顯強(qiáng)于野生型煙草,存活率普遍高于野生型煙草的存活率；在低溫脅迫后細(xì)胞膜受傷程度較低,細(xì)胞膜脂過氧化程度低,MDA含量較少,電解質(zhì)滲出較少,相對(duì)電導(dǎo)率較低,并積累了大量脯氨酸以維持細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)滲透壓,表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗凍性。綜合比較多個(gè)指標(biāo)得出各材料抗寒能力依次為：轉(zhuǎn)TaIRl6煙草轉(zhuǎn)TaIRI4煙草野生型煙草。3.小麥族IRI基因家族分離及進(jìn)化分析在小麥野生近緣屬種材料中廣泛分離得到22個(gè)IRI基因,這些基因以基因家族形式存在,都具有IRI蛋白的典型保守區(qū)特征,包括N端信號(hào)肽、LRR區(qū)、IRI區(qū)及若干個(gè)保守半胱氨酸。進(jìn)化分析表明,小麥族IRI基因與其同源基因聚為9類,這些基因之間存在種屬特異性,其中,所有山羊草屬IRI基因單獨(dú)聚為一類(Group I)；多數(shù)小麥屬IRI基因單獨(dú)聚為一類(Group II)；大麥屬部分基因與小麥屬基因聚在Group II,其余分別聚在GroupⅦ和GroupⅧ；發(fā)草屬基因聚在GroupⅣ和GroupⅥ。山羊草屬與小麥屬親緣關(guān)系最近。這些基因與PSR基因具有很高的同源性,推測IRI蛋白可能為雙功能蛋白。
【關(guān)鍵詞】：小麥族 抗寒性 重結(jié)晶抑制蛋白基因 進(jìn)化分析
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;S512.1
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-22
• 1.1 AFPs的概述14-17
• 1.1.1 AFPs的發(fā)現(xiàn)14
• 1.1.2 AFPs的分類及特點(diǎn)14-16
• 1.1.3 AFPs的性質(zhì)16-17
• 1.2 植物AFPs的研究進(jìn)展17-19
• 1.2.1 植物AFPs的特性17-18
• 1.2.2 植物AFPs結(jié)構(gòu)特點(diǎn)18
• 1.2.3 植物AFPs的高級(jí)結(jié)構(gòu)18-19
• 1.3 AFPs的應(yīng)用19-20
• 1.3.1 AFPs在食品領(lǐng)域的應(yīng)用19
• 1.3.2 AFPs在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用19-20
• 1.4 小麥族AFPs研究進(jìn)展20-22
• 第二章 強(qiáng)冬性小麥IRI基因的分離、序列比對(duì)及表達(dá)分析22-33
• 2.1 試驗(yàn)材料22-23
• 2.1.1 植物材料與處理22
• 2.1.2 菌株及質(zhì)粒22
• 2.1.3 其它試劑22-23
• 2.1.4 所用儀器及生物學(xué)軟件23
• 2.2 試驗(yàn)方法23-26
• 2.2.1 總RNA的提取23
• 2.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA23
• 2.2.3 IRI基因的PCR擴(kuò)增23-24
• 2.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收24
• 2.2.5 TA克隆24
• 2.2.6 序列測定與分析24
• 2.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR24-26
• 2.3 結(jié)果與分析26-32
• 2.3.1 植物總RNA的提取26
• 2.3.2 小麥IRI基因的分離26-27
• 2.3.3 小麥IRI氨基酸序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)分析27-30
• 2.3.4 小麥IRI基因家族分子進(jìn)化分析30
• 2.3.5 小麥IRI基因家族各成員表達(dá)分析30-32
• 2.4 結(jié)論32-33
• 第三章 轉(zhuǎn)基因煙草檢測及抗寒功能鑒定33-43
• 3.1 試驗(yàn)材料33-34
• 3.1.1 植物材料與處理33
• 3.1.2 試驗(yàn)試劑及配制33-34
• 3.1.3 所有儀器及生物學(xué)軟件34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 3.2.1 探針的制備34-35
• 3.2.2 探針濃度的定量標(biāo)記35
• 3.2.3 Southern雜交步驟35-36
• 3.2.4 低溫脅迫試驗(yàn)36-37
• 3.3 結(jié)果與分析37-41
• 3.3.1 定量標(biāo)記探針效率結(jié)果37
• 3.3.2 Southern雜交結(jié)果37-38
• 3.3.3 表型鑒定結(jié)果38-39
• 3.3.4 存活率測定39
• 3.3.5 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)電導(dǎo)率變化39-40
• 3.3.6 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸變化40-41
• 3.3.7 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草MDA變化41
• 3.4 結(jié)論41-43
• 第四章 小麥族IRI基因分離及進(jìn)化分析43-54
• 4.1 試驗(yàn)材料43
• 4.1.1 植物材料與處理43
• 4.1.2 菌株及質(zhì)粒43
• 4.1.3 其它試劑43
• 4.1.4 所用儀器及生物學(xué)軟件43
• 4.2 試驗(yàn)方法43-44
• 4.2.1 總RNA的提取43-44
• 4.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA44
• 4.2.3 IRI基因的PCR擴(kuò)增44
• 4.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收44
• 4.2.5 TA克隆44
• 4.2.6 序列測定與分析44
• 4.3 結(jié)果與分析44-52
• 4.3.1 所獲序列基本信息44-46
• 4.3.2 所獲序列比對(duì)分析結(jié)果46-50
• 4.3.3 小麥族IRI基因及其相關(guān)基因進(jìn)化分析50-52
• 4.4 結(jié)論52-54
• 第五章 討論與結(jié)論54-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 致謝61-62
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章62

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