本文關(guān)鍵詞：酒石酸衍生的陽離子脂質(zhì)材料的制備及其基因轉(zhuǎn)染活性研究

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【摘要】：目的:基因治療需要高效安全的載體系統(tǒng)將基因遞送到靶細胞或細胞核內(nèi)�；蛑委熭d體主要分為病毒載體與非病毒載體兩大類。非病毒載體因其負載量大,穩(wěn)定性和安全性高,易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點,成為目前基因載體研究的熱點。陽離子脂質(zhì)體是目前研究最為廣泛的非病毒載體,在基因治療中具有廣闊的發(fā)展與應(yīng)用前景。本論文以酒石酸為骨架,通過在酒石酸羥基端引入氨基己酸為陽離子頭部,在其羧基端引入不同長度的疏水鏈制備得到新型骨架的陽離子脂質(zhì)材料,以期為基因治療提供高效低毒的載體。方法:以L-(+)-酒石酸,6-氨基己酸,長鏈烷基胺或醇(辛胺,十二胺,十六胺,辛醇,十二醇,十六醇)等為原料,構(gòu)建了單鏈陽離子脂質(zhì)材料(TS1-TS3)和雙鏈陽離子脂質(zhì)材料(TD1-TD3)。采用質(zhì)譜、核磁、紅外等方法對合成的材料進行結(jié)構(gòu)鑒定。將上述脂質(zhì)材料與輔助脂質(zhì)DOPE按照一定比例混合,采用薄膜分散法制備得到陽離子脂質(zhì)體并對其進行表征和細胞毒性評價。采用凝膠電泳阻滯方法考察所得6種陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA的復(fù)合能力和核酶降解保護作用,為基因轉(zhuǎn)染篩選適宜的N/P比。以293T細胞和報告基因p EGFP-N1為模型,采用流式細胞儀和熒光顯微鏡對上述陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染能力進行初步評價。對初篩轉(zhuǎn)染活性較好的陽離子脂質(zhì)材料進行處方優(yōu)化,并進一步考察其在He La細胞中的轉(zhuǎn)染活性。選用不同細胞內(nèi)吞途徑抑制劑觀測TD2/DNA復(fù)合物的入胞機制。結(jié)果:設(shè)計合成了6種基于L-(+)-酒石酸的陽離子脂質(zhì)材料,包括3種單鏈陽離子脂質(zhì)材料TS1-TS3和3種雙鏈陽離子脂質(zhì)材料TD1-TD3,經(jīng)1H NMR,MS和IR等方法鑒定,所得脂質(zhì)材料的結(jié)構(gòu)與目標物的結(jié)構(gòu)一致。陽離子脂質(zhì)體粒徑及zeta電位測定結(jié)果表明,所制備的6種陽離子脂質(zhì)體粒徑均小于150 nm,zeta電位均在35 m V以上,滿足基因遞送載體的要求。MTT細胞毒性實驗結(jié)果表明,所設(shè)計的陽離子脂質(zhì)材料毒性較低,具有較好的生物相容性,上述陽離子脂質(zhì)體除TD1外,IC50均大于陽性對照DOTAP。凝膠阻滯實驗結(jié)果顯示,在N/P比小于3的情況下,所制備的陽離子脂質(zhì)體均能與DNA完全復(fù)合,具有較強的攜載DNA能力。6種載體材料在293T細胞中的基因轉(zhuǎn)染活性測定結(jié)果表明,單鏈陽離子脂質(zhì)材料TS1-TS3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染活性均較差,與裸DNA幾乎無差異。雙鏈陽離子脂質(zhì)材料TD1轉(zhuǎn)染能力較弱,TD2和TD3具有較好的轉(zhuǎn)染活性。TD2和TD3的進一步處方優(yōu)化結(jié)果顯示,最優(yōu)脂質(zhì)材料/DOPE比例分別為1:0.5和1:2;最優(yōu)N/P比均為1:1。與陽性對照DOTAP相比,TD2(MFI153.3±14.7)和TD3(MFI 190.5±7.8)的平均熒光強度與DOTAP(MFI 171.1±14.5)無顯著性差異,但TD2(47.7%±7.0%)與TD3(32.9%±2.0%)兩者的陽性轉(zhuǎn)染細胞百分數(shù)均高于DOTAP(24.7%±1.8%;P0.01),具有更好的轉(zhuǎn)染活性。He La細胞上的轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表明,TD2(MFI 53.8±6.2)和TD3(MFI 54.7±2.0)的平均熒光強度雖小于DOTAP(MFI 98.0±1.8,P0.01),但TD3(19.6%±0.9%)的陽性轉(zhuǎn)染細胞百分數(shù)與DOTAP(18.3%±0.9%)相當,TD2(25.6%±0.4%)的陽性轉(zhuǎn)染細胞百分數(shù)仍優(yōu)于DOTAP,具有較強的基因轉(zhuǎn)染能力。TD2/DNA復(fù)合物入胞機制研究結(jié)果表明,TD2與DNA形成的復(fù)合物主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的途徑入胞。結(jié)論:本論文在L-(+)-酒石酸骨架中引入6-氨基己酸作為陽離子頭部,引入不同長度的疏水鏈分別構(gòu)建了單鏈與雙鏈疏水尾部的6種陽離子脂質(zhì)材料并對其細胞毒性和基因轉(zhuǎn)染活性進行研究。研究結(jié)果顯示,除TD1外,上述陽離子脂質(zhì)材料所得基因載體具有粒徑均一,細胞毒性小,攜載和保護DNA能力強等優(yōu)點。其中TD2陽離子脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)染能力最強,在293T和He La細胞系上均顯示很好的轉(zhuǎn)染活性,且TD2與DNA形成的復(fù)合物主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的途徑入胞,該途徑可以避免被溶酶體降解,有利于提高該類基因遞送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率。
【關(guān)鍵詞】：非病毒載體 陽離子脂質(zhì)體 陽離子脂質(zhì) L-(+)-酒石酸 細胞毒性 基因轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-13
• 文獻回顧13-29
• 第一部分 L-（+）-酒石酸陽離子脂質(zhì)材料的合成及其結(jié)構(gòu)表征29-42
• 1 材料29-30
• 2 方法30-40
• 3 結(jié)果與討論40-42
• 第二部分 陽離子脂質(zhì)體的制備、表征及體外毒性的研究42-47
• 1 材料42
• 2 方法42-44
• 3 結(jié)果與討論44-47
• 第三部分 陽離子脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)染活性及入胞機制研究47-59
• 1 材料47-48
• 2 方法48-51
• 3 結(jié)果與討論51-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻60-72
• 附錄72-100
• 個人簡歷和研究成果100-101
• 致謝101

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1 賈奕揚;酒石酸衍生的陽離子脂質(zhì)材料的制備及其基因轉(zhuǎn)染活性研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

2 劉成容;以人體內(nèi)源單體精胺為基本單元構(gòu)建的基因載體的合成、表征及生物檢測[D];吉林大學(xué);2010年

3 齊巖;新型細胞核靶向基因載體的研究[D];黑龍江大學(xué);2009年

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本文編號：1067032